基于昆虫细胞的蛋白质表达

赛默飞世尔科技提供各种杆状病毒系统（表 3.1）以满足您的需求：

• Invitrogen BaculoDirect 杆状病毒表达系统是一种快速简单的重组杆状病毒生成法。BaculoDirect 线性 DNA 包括 attR 位点，用于与 Invitrogen Gateway 入门克隆快速高效地进行重组克隆。所得的重组 DNA 直接从 Gateway LR 反应混合物中获取，并用于转染昆虫细胞，可节省大量时间。可在一周时间内分离得到纯化的病毒。BaculoDirect 系统缩短了手动操作时间，使其成为高通量表达的理想选择。
• Invitrogen Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统使用一种通过位点特异性转座进行重组的独特杆粒穿梭载体，在细菌细胞中生成表达的杆粒。随后，表达的杆粒转染至昆虫细胞中以生成重组杆状病毒。
• Invitrogen Bac-N-Blue 杆状病毒表达系统用于生产高水平重组蛋白已有十多年。
• 果蝇 表达系统（DES）使用充分表征的 果蝇 Schneider S2 细胞和简单表达载体，以实现重组蛋白的稳定或短暂表达。
   

表 3.1.基于杆状病毒的表达系统以及每种系统的优势。

昆虫细胞中蛋白质的表达高峰取决于多种因素，包括：多重性感染（MOI）、表达时间和所表达的特异性蛋白。您的系统优化指南包括使用 5-10 的 MOI 以及表达时间为 48 – 72 小时。由于高病毒载量可导致细胞过程故障，因此在 72 小时后表达的蛋白质可能出现畸变。

昆虫细胞的病毒感染通常会经历 3 个阶段，可以使用放大 40 倍至 400 倍的倒置相位显微镜目视观察。病毒感染的各个阶段（假定转染效率高）为：

早期

• 细胞直径增加——可观察到细胞直径增加 25 – 50%
• 细胞核大小增加——细胞核可能显示为“填满”细胞

晚期

• 细胞生长停止——与仅含细胞的对照相比，细胞似乎停止生长
• 粒状外观
• 病毒出芽的迹象——细胞囊泡外观
• 病毒包含体——少数细胞会含有包含体，在昆虫细胞核中显示为折射晶状体
• 分离——细胞从培养皿或培养瓶中释放

极晚期

• 少数细胞中可充满包含体病毒、死亡和破裂病毒，在单细胞层中留下了清除迹象

制备病毒储备液后，强烈建议测定储备液的滴度。您可以进行噬菌斑测定确定病毒储备液的滴度。进行噬菌斑测定的主要步骤如下：

• 以 80% 汇合度将细胞置于 6 孔板中
• 制备一系列 P1 病毒储备稀释液并添加至细胞中
• 在 27°C 下孵育1小时
• 将 1% 熔化的琼脂糖混合至新鲜培养基中
• 去除病毒上清液
• 用含琼脂糖培养基覆盖细胞
• 将孔板放置 2-3 小时，使琼脂完全固化
• 将孔板培养 10-14 天
• 计数斑块

在进行此项检测时，我们建议：

• 使用健康良好、低传代（10 – 20）、对数期生长和高生命力（>95%）的细胞
• 检查病毒储备液是否无菌（无细菌污染）
• 使用高质量、低熔点琼脂糖
• 含琼脂糖的培养基温度至关重要——过热，细胞会死亡；但如果温度过低，它会迅速固化
• 在覆盖后取出孔板前等待 2 – 4 小时，以便琼脂糖完全固化
• 在稀释孔板上对斑块进行计数

使用此方程式计算病毒滴度：
PFU/mL = 斑块数量（PFU）/稀释因子 x 接种 mL

我们建议使用滴度为 ≥1 x 10⁸ PFU/mL 的病毒储备液进行表达研究。为扩增您的病毒储备液，请在 0.05 至 0.1 的 MOI 范围内感染细胞（MOI 定义为每个细胞的病毒颗粒数量）。备注：如果您尚未确定 P1 病毒储备液的滴度，您可以假定滴度范围为 1 x 10⁶ 至 1 x 10⁷ PFU/mL。

赛默飞世尔科技 Gibco 昆虫培养基精心调配的配方可实现最高生长率和蛋白产率。这些培养基与 Gibco 预适应的细胞系（表 3.2）联用，可提供一种便捷系统，从而为您节省时间和工作量。

参见昆虫培养基选择表

昆虫细胞对环境因素非常敏感。除化学和营养培养因素外，物理因素也会影响昆虫细胞生长；因此，需要进行优化来尽可能提高细胞生长。

培养昆虫细胞时，请考虑以下因素：

• 温度——培养和感染培养的昆虫细胞的最佳温度范围为 27°C 至 28°C
• pH——大多数培养系统可在 6.1 到 6.4 的范围内良好运行。Gibco Sf-900 II SFM 在正常空气和开盖培养系统条件下可维持在该范围内的 pH 值。
• 渗透浓度——培养基的最佳渗透浓度通常为 345 至 380 mOsm/kg，具体情况取决于所用细胞系
• 通气——昆虫细胞需要被动氧气扩散，以实现最佳的生长和重组蛋白表达。活性或受控的氧化系统需要以 10% 至 50% 的空气饱和度为单位的溶解氧。
• 剪切力——悬浮培养液产生机械剪切力。在含血清培养基（10% 至 20% FBS）中生长的昆虫细胞通常能充分保护细胞免受剪切力影响。如果您在无血清条件下培养昆虫细胞，可能需要补充剪切力保护剂，如 Gibco Pluronic F-68 非离子表面活性剂。备注：在 Sf-900 II SFM 或 Gibco Sf-900 III SFM 中生长的细胞无需添加剪切力保护剂。

有关昆虫细胞培养的更多信息，请参阅 《杆状病毒表达载体系统（BEVS）和昆虫细胞培养技术指南》。

表 3.2.我们携带的最受欢迎细胞系的细胞培养条件汇总。

BaculoDirect 杆状病毒表达系统

BaculoDirect 杆状病毒表达系统使用快速 1 小时 Gateway 重组反应，生成必要的转染杆粒（图 3.1），有助于节省生产重组杆状病毒所需的天数。通常可在不到一周内分离得到纯化的杆状病毒BaculoDirect 系统的主要优势包括：

• 快速方法可在极短时间内生成重组病毒
• 强多角体蛋白启动子，可实现高水平的表达
• C 端或 N 端 6xHis 和 V5 标签可实现重组蛋白的轻松检测和纯化
• 灵活 Gateway 克隆允许使用任意入门载体
• 使用更昔洛韦进行非重组病毒阴性选择的胸苷激酶（TK）基因
• 用于快速测定重组病毒纯度的lacZ 基因
• 简单成熟的高通量表达方案

请注意，该 DNA 为线性 DNA ，因此生成非重组病毒的可能性极小。

我们的工程化 BaculoDirect 线性 DNA 包含 attR 位点，用于将您的目标基因重组克隆至 Invitrogen Gateway 入门克隆中。只需将入门克隆与 BaculoDirect 线性 DNA 和 Invitrogen Gateway LR Clonase 酶混合，孵育 1 小时，随后转染 Sf9 或 Sf21 昆虫细胞以产生重组病毒。由于转染效率较低，我们不建议使用 Invitrogen High Five 细胞来生成病毒储备液。在生成高滴度病毒储备液后，您可以使用 Sf9、Sf21、High Five 或 Invitrogen Mimic Sf9 细胞进行蛋白表达。无需进行细菌转化和大杆粒分离或共转染转移载体和线性杆状病毒 DNA 进入昆虫细胞。因此，手动操作时间大大缩短，可在 1 周内分离得到纯化的杆状病毒。

BaculoDirect 线性 DNA 旨在用于简单的重组杆状病毒生成和昆虫细胞表达（图 3.2）。除 attR 位点以快速 Gateway 重组克隆外，骨架中还包含强多角体蛋白启动子，以实现高蛋白表达，并含有 C 端或 N 端 6xHis 和 V5 标签，用于检测和纯化。

Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统

Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统依赖于通过 大肠杆菌 位点特异性转位而不是昆虫细胞中的同源重组进行的重组杆状病毒生成生产重组杆状病毒。pFastBac 载体表达盒与 DH10Bac 大肠杆菌 中的亲本杆粒重组，以形成表达杆粒。亲本杆粒包含 lacZ α 互补因子，可用于阳性重组体的高效蓝/白斑筛选。然后，杆状病毒质粒转染到昆虫细胞中以生成重组杆状病毒颗粒（图 3.3）。

Bac-to-Bac 表达系统的主要优势包括：

• 高达 10⁸ PFU/mL 的高滴度能够实现大规模蛋白表达
• pFastBac 载体包含多角体蛋白启动子，以获得高得率的重组蛋白
• 可靠，快速 5 分钟平末端 TOPO 克隆有助于节省时间
• N 和 C 端 6xHis 标签，便于纯化
• TEV 蛋白酶位点可去除 N- 或 C 端标签以生成天然蛋白

该 pFastBac 载体可提供强多角体蛋白启动子以用于蛋白表达，以及大型多克隆位点以简化克隆。Invitrogen Bac-to-Bac HBM TOPO 分泌表达系统能够通过蜜蜂蜂毒肽（HBM）分泌信号实现分泌蛋白的表达，适用于需要存在分泌信号才可进行糖基化的毒性蛋白和糖蛋白。此外，杆状病毒分泌的糖蛋白也可以很容易地在 体外去糖基化—这是蛋白质结晶的重要特征。关于杆状病毒的包裹限制，杆状病毒杆将根据包裹 DNA 的需要继续延长。因此，该系统理论上可以容纳数百千碱基。标准克隆技术将限制插入物大小，然后包裹限制才会成为问题。

Bac-N-Blue 转染试剂盒

存在于 Invitrogen Bac-N-Blue 转染试剂盒 中的 Bac-N-Blue 线性 DNA 专为与 pBlueBac 和 pMelBac 载体重组而设计。重组病毒具有全长、功能性 lacZ 基因，可产生蓝色斑块。这便于鉴别和纯化。Bac-N-Blue 线性 DNA 可与任何基于多角体蛋白启动子的杆状病毒转移载体配合使用。DNA 在三个位点进行线性化，其中一个位于对病毒增殖至关重要的基因中。这导致非重组病毒的减少，有助于使重组病毒的选择和纯化变得简单。

果蝇 表达系统（DES）

DES 系统具有多种优势，包括：

• 直接生成可稳定表达高水平蛋白质的昆虫细胞系
• 各种载体，具有诱导启动子（金属硫因启动子）等特点，用于表达毒性蛋白，分泌信号和标签
• 使用 Invitrogen 果蝇 S2 细胞可轻松进行高密度细胞培养
• 非溶解性表达可减少降解

通过将 DES 表达载体与选择载体 pCoBlast 或 pCoHygro 共转染，生成稳定 S2 细胞系（图 3.4）。当表达构建体位于 S2 细胞内，含有您目标基因的表达质粒的数百个拷贝将自发整合至基因组中。在选择几周后，您可以建立稳定表达高水平蛋白的多克隆细胞系。