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蛋白表达概述
如何制备蛋白
蛋白的合成和调控取决于细胞的功能需求。蛋白的蓝图存储在 DNA 中，DNA 被严格调控的转录过程用作模板来产生信使 RNA (mRNA)。然后，通过 mRNA 编码的信息被翻译成形成蛋白的已定义氨基酸序列（图 1.1）。转录是信息从 DNA 转移到 mRNA 的过程，而翻译是根据 mRNA 指定的氨基酸序列合成蛋白的过程。
图 1.1. 转录和翻译的简图。这描述了从 DNA 碱基对序列（基因）到氨基酸多肽序列（蛋白）的一般信息流。
在原核生物中，转录和翻译过程同时发生。mRNA 的翻译甚至在成熟的 mRNA 转录本完全合成之前就开始了。基因的这种同时转录和翻译被称为偶联转录和翻译。在真核生物中，这些过程在空间上是分离的且按顺序发生，其中转录发生在细胞核中，而翻译发生在细胞质中。翻译后，多肽以各种方式被修饰以完成其结构、指定其位置或调节其在细胞内的活性。翻译后修饰 (PTM) 是对新合成蛋白的化学结构的各种添加或改变，是整个细胞生物学的关键特征。
一般来说，蛋白组学研究涉及研究蛋白的任何方面，例如结构、功能、修饰、定位或与蛋白或其他分子的相互作用。为了研究特定蛋白如何调节生物学，研究人员通常需要一种生产（制造）目标功能性蛋白的方法。鉴于蛋白的大小和复杂性，从头合成对于此项工作来说并不是一个可行的选择。相反，活细胞或其细胞机制可以被用作工厂，根据提供的遗传模板来构建和构造蛋白。与蛋白不同，DNA 可以通过成熟的重组 DNA 技术在合成或体外轻松构建。因此，特定基因的 DNA 序列可作为后续蛋白表达的模板构建（图 1.2）。以此类 DNA 模板产生的蛋白称为重组蛋白。
图 1.2.典型的蛋白表达工作流程。
针对蛋白表达的克隆技术
克隆是指将 DNA 片段或目标基因从一种生物体转移到自我复制的基因元件（如表达载体）的过程（图 1.3）。
图 1.3. 基本克隆载体。
典型表达载体包括至少 4 个关键元件：
- 目的基因 (GOI) 表达盒（包括启动子和基因终止或 poly (A) 信号）
- 细菌复制起点 (ori)
- 特定宿主的抗生素选择盒（例如，具有对杀稻瘟菌素 S、Geneticin 选择性抗生素、潮霉素 B、霉酚酸、嘌呤霉素、Zeocin 选择试剂的抗性）
- 大肠杆菌抗生素选择盒（例如，具有对氨苄青霉素、杀稻瘟菌 素 S、羧苄青霉素、Zeocin 选择试剂的抗性）
其他要素可能包括：
- 多克隆位点 (MCS)（即多交联剂）
- 抗原决定簇标签
- 分泌信号
- 蛋白酶识别位点
- 内部核糖体进入位点 (IRES)
大多数载体包含用于通过特定宿主系统进行表达的启动子，但一些载体提供了添加您自己的启动子的选项。表 1.1 列出了常见的组成型和诱导型启动子。
表 1.1. 通常用于重组蛋白表达系统的组成型和诱导型启动子。
| 宿主 | 表达系统 | 组成型启动子 | 诱导 | 诱导型启动子 |
|---|---|---|---|---|
| 哺乳动物 | 体内 | CMV (巨细胞病毒)；EF-1 α（人延伸因子 α）1；UbC（人泛素 C）；SV40（猿猴病毒 40） | 含 TetO2（四环素操纵子）的启动子；含 GAL4-UAS 的启动子（酵母菌 GAL4 上游激活序列） | 四环素或多西环素；米非司酮 |
| 无细胞（兔网织红细胞） | 无 | 不适用 | 不适用 | |
| 无细胞（HeLa 或 CHO） | 需要 T7 启动子和 T7 RNA 聚合酶进行转录 | 不适用 | 不适用 | |
| 昆虫 | 体内 | Ac5（肌动蛋白）；OpIE1 &2；PH（多角体蛋白）；p10 | MT（金属硫蛋白） | 铜 |
| 酵母 | 体内 | GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） | AOX1（醛氧化酶）；GAL1（半乳糖激酶） | 甲醇；半乳糖 |
| 大肠杆菌 | 体内 | 不常见 | Lac（乳糖操纵子）； araBAD（L-阿拉伯糖操纵子） | IPTG；L-阿拉伯糖 |
| 无细胞 | 需要 T7 启动子和 T7 RNA 聚合酶进行转录 | 不适用 | 不适用 |
根据宿主系统，需要考虑的另一个重要因素是包括 Shine-Dalgarno 核糖体结合序列（对于原核生物系统）或 Kozak 共有序列（对于真核生物系统）。
抗原决定簇标签常用于通过将标签的编码序列与基因融合来轻松检测或快速纯化您的目标蛋白。抗原决定簇标签可以位于重组蛋白的 N 端或 C 端。表 1.2 提供了一些帮助选择抗原决定簇标签的基本指南。
表 1.2. 各种抗原决定簇标签的典型应用。
| 目的 | 描述 | 标签示例 |
|---|---|---|
| 检测 | 针对标签提供充分表征的抗体，易于可视化 | V5、Xpress、myc、6XHis、GST、BioEase 标签、capTEV 标签、GFP、Lumio 标签、HA 标签、FLAG 标签 |
| 纯化 | 提供树脂以促进纯化 | 6XHis、GST、BioEase 标签、capTEV 标签 |
| 切割 | 蛋白酶识别位点（TEV、EK、HRV3C、Xa 因子），可在表达后去除标签以获得天然蛋白 | 任何标签后面带有蛋白酶识别位点的标签（仅在 N 端） |
基因及其变体可以通过 PCR 制备，分离为 cDNA 克隆，或合成为 Invitrogen GeneArt Strings DNA 片段或文库。或者，基因可以通过 Invitrogen GeneArt 基因合成或定向进化定制服务合成。在我们的基因到蛋白手册中了解有关构建基因的更多信息。
Thermo Fisher Scientific 提供各种独特的克隆技术，以将目标基因传递到合适的载体中，简化克隆程序并帮助加速蛋白表达。
- 限制性内切酶酶切以及连接克隆是分子生物学家的行业标准
- Invitrogen Gateway 技术在载体选择和下游应用中提供较大的灵活性
- Invitrogen TOPO 克隆可提供简单便利的反应，通常所需时间少于 5 分钟
- Invitrogen GeneArt 无缝克隆和基因组装克隆允许在 30 分钟的室温反应中将最多 4 个大的 DNA 片段同时克隆到几乎任何线性化的大肠杆菌载体中（总大小最多为 40 kb）
- Invitrogen GeneArt IIs 型组装可避免同源重组，可同时克隆多达 8 个同源或重复序列片段而不会留下任何痕迹
- GeneArt 基因合成提供 100% 的序列准确性和基因优化，帮助最大限度地提高蛋白表达率
转化和质粒分离
克隆完成后，通过一个称为转化的过程，将质粒摄取到感受态细胞（化学感受态或电转感受态大肠 杆菌）中进行增殖和储存。化学感受态细胞经盐处理，以打开细胞膜和细胞壁上的孔。然后将质粒 DNA 添加到细胞中，轻度热休克会打开大肠 杆菌细胞中的孔，从而允许质粒进入。相比之下，当将短电脉冲传递到细胞和质粒 DNA 混合物中时，DNA 通过大肠 杆菌膜和细胞壁中形成的瞬时孔引入电转感受态细胞。选择使用感受态细胞株时，重要的是考虑以下因素：
- 基因型—菌株中将其与野生型大肠 杆菌区分开来的基因突变（缺失、改变或插入）列表
- 转化效率—成功转化到一定量细胞中的超螺旋质粒（如 pUC19）的数量测量；定义为每微克 DNA 递送的菌落形成单位 (cfu/μg)；我们生产的感受态细胞的转化效率范围为 >1 x 106 至> 3 x 1010 cfu/μg
- 应用—适合感受态细胞的实验类型；应用包括常规克隆、蛋白表达、文库生产、克隆不稳定 DNA、ssDNA 增殖、杆状病毒质粒创建和 Cre-Lox 重组
- 试剂盒形式—包括高通量（96 孔）、一次性 Invitrogen One Shot 小瓶、标准试剂盒或批量形式
在利用大肠杆菌的分子机制复制质粒 DNA 后，质粒纯化试剂盒可用于纯化质粒。
DNA（包含您的目标基因）。我们提供两种主要的质粒纯化技术：
- 阴离子交换
- 二氧化硅
为了纯化将用于转染至细胞系以进行蛋白表达的克隆质粒，我们建议使用更高纯度和更低内毒素水平的阴离子交换纯化。硅胶基质的纯化适用于克隆相关工作流程，但对于用于转染的质粒而言并非最理想的选择，因为其中含有较高水平的内毒素和杂质。阴离子交换柱还使用大质粒可获得更好的结果。Invitrogen PureLink HiPure Expi 质粒试剂盒开发用于从大规模质粒分离中获得更高的得率，所需时间不到典型质粒 DNA 分离方法的一半。
选择表达系统
针对您的特定应用使用正确的表达系统是成功的关键。蛋白的溶解度、功能性、纯化速度和产量通常是选择表达系统时需要考虑的关键因素。此外，每个系统都有自己的优势和挑战，这在选择表达系统时非常重要。我们提供 6 种独特的表达系统：哺乳动物、昆虫、酵母、细菌、藻类和无细胞系统。表 1.3 总结了这些表达系统的主要特性，包括每个系统最常见的应用、优势和挑战。
选择系统后，需要考虑基因递送方法来进行蛋白表达。基因递送的主要方法包括转染和转导。
转染是将核酸引入哺乳动物和昆虫细胞的过程。方案和技术多种多样，包括脂质转染、化学和物理方法，例如电穿孔。
查看不同的转染方法或我们的转染试剂选择指南
对于不适合脂质体介导转染的细胞类型，通常采用病毒载体。病毒介导的转染，也称为转导，提供了一种达到难以转染的细胞类型以进行蛋白过度表达或敲低的方法，它是临床研究中最常用的方法。腺病毒、致癌逆转录病毒、慢病毒和杆状病毒载体已广泛用于在细胞培养和体内向哺乳动物细胞递送基因。
细胞裂解和蛋白纯化
蛋白表达之后的下一步通常是分离和纯化目标蛋白。通过选择正确的裂解试剂和适当的纯化树脂可以最大限度地提高蛋白的产量和活性。我们提供针对特定宿主系统进行优化的细胞裂解配方，包括培养的哺乳动物、酵母、杆状病毒感染昆虫和细菌细胞。大多数重组蛋白表达为带短亲和标签的融合蛋白，如多聚组氨酸或谷胱甘肽 S 转移酶，可选择性纯化目标蛋白。使用固定化金属亲和层析 (IMAC) 树脂纯化重组 His 标签蛋白，使用还原型谷胱甘肽树脂纯化 GST 标签蛋白。
表 1.3. 各种重组蛋白表达系统的特征。
| 表达系统 | 最常见的应用 | 优势 | 挑战 |
|---|---|---|---|
哺乳动物 |
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昆虫 |
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酵母 |
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细菌 |
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藻类 |
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无细胞 |
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。