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(包括传统产品的结构 & 谱图)

生物正交标记和点击化学的原理

胺和硫醇反应性标记化学试剂如 荧光基团及其胺反应性衍生物 - 第 1 章 和 硫醇反应性探针 - 第 2 章 所述通常通过两种方式之一使用：(1) 纯化蛋白或其他生物聚合物产生偶联物的标记，这种偶联物随后应用于细胞或组织标本，或 (2) 总细胞硫醇或胺含量的非选择性原位标记。原位 标记特定分子群(例如在您感兴趣实验时间段内新合成的蛋白质和核酸)是不可行的，因为胺基和巯基在细胞和培养细胞的培养基中分布都很普遍。Invitrogen™ Click-iT™ 标记技术通过引入生物正交反应化学解决了这些困难，生物正交反应化学中的反应物没有存在于生物分子、细胞、组织和模式生物中的内源性对应物。ref 除了反应选择性， 原位 标记方法允许反应在温和的条件下、大多数可以在水溶液条件下进行。

虽然一些已知的化学反应可以满足以上的要求，ref Click-iT标记技术仍被认为是目前最成功、最通用的生物正交标记技术，即铜催化的叠氮化物和炔烃 环加成反应ref (图3.1.1)。应用该反应来 原位 标记细胞需要两个步骤。第一步，其中一个反应物（叠氮或炔烃化合物）与"组块"（如核酸、核苷、氨基酸、单糖、脂肪酸）相连接（通过生物合成的方法掺入）。随后，另外一个反应物（与荧光染料、生物素或其他检测试剂连接的炔烃化合物或叠氮）在催化剂Cu(I)的作用下，被"点击"到位。其中，反应物的一方必须是叠氮化物而另一方必须是炔基衍生物，但其中任何一种都可以作为生物合成的掺入分子，而对应的另外一种作为探测分子来发挥作用 ref(例如图3.1.1B所示的：L-叠氮同丙氨酸(AHA)+ Invitrogen™ Alexa Fluor™ 488 炔烃化合物的不可逆反应过程)

叠氮和炔烃反应物的一个重要特征是其较小的体积 (图3.1.2) 。表达标签(如绿色荧光蛋白 (GFP))提供的是最佳的特异性标记，因为其与目的蛋白的连接是基因决定的。一旦GFP被导入细胞(备注 11.1 - BacMam基因导入和表达技术)，GFP利用细胞自身的转录和翻译机制进行了原位标记，而不受外界干扰的影响。然而，由于GFP体积的限制，(约27000 道尔顿)有时会产生功能的干扰，这一弱点也促使了替代品的研发，这便是体积更小的表达标签，如- TC-FlAsH 四半胱氨酸标签和二砷配体系统(T34561, T34562, T34563; 第2.2节 - 可见光激发的硫基反应性探针)。此外，核酸、脂质体、多糖和翻译后蛋白修饰只能通过遗传编码的蛋白报告基因间接检测。叠氮和炔烃化合物标记的小体积，允许其由酶(如核苷酸聚合酶和氨酰tRNA合成酶)催化到生物合成的“组块”中，这些酶对于具有较大修饰作用(如荧光有机染料)的底物的耐受性较弱。ref

叠氮和炔烃反应物之间的1,2,3-三氮唑链(图3.1.1)非常稳定。很难被水解、氧化或还原，在质谱 (MS) 分析中还能保持其离子峰。该反应还具有选择性，可得到唯一的1,4-二取代的1,2,3-三氮唑链(图3.1.1)。采用Cu(I)催化剂是该反应的基本特点，在应用的时候，这也是最容易出问题的一环。ref Cu离子(I)催化可使反应加速 >106倍，没有铜的催化，反应进行的非常缓慢。出于方便的考虑，通常通过利用抗坏血酸盐或磷酸三氯乙酯 (T2556, 硫基修饰和检测介绍 - 第2.1节) 还原添加的过量二价铜，从而 原位 制备Cu离子(I)。在强氧化条件下，还原能力不足会造成 原位 反应减弱。ref 由于铜使蛋白质和核酸对氧化伤害更敏感，因此铜具有细胞毒性，从而限制了叠氮炔烃环加成反应在肝脏细胞中的应用。铜/抗坏血酸盐处理，还会导致R-藻红蛋白和GFP荧光的消减。ref 综合分析这些因素，并结合铜催化的叠氮炔烃环加成反应中生物偶联应用相关的一系列可行性建议，Finn和他的同事们在杂志上发表了一篇精彩的分析论文。ref 我们的Click-iT产品组合包括单独的叠氮和炔烃化合物标记试剂以及应用特异性试剂盒，将在下文详述。

Click-iT reactions
图3.1.1 Click-iT铜催化的叠氮炔烃化合物环加成反应适用于检测：A) 核酸、B) 蛋白质、C) 碳水化合物和 D) 脂类。反应物为 A) 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU) 和Alexa Fluor 488 叠氮化物；B) L-高丙氨酸(HPG) 和Alexa Fluor 488 叠氮化物；C) N-叠氮基乙酰半乳糖胺和Alexa Fluor 488炔烃化合物；D) 15-叠氮基十五酸和Alexa Fluor 488 炔烃化合物。在每一种情况下, 前者均是代谢的前体，可通过 新 合成或翻译后修饰掺入蛋白质和核酸。


图 3.1.2 细胞学分析中常用探测分子的相对大小。因为叠氮和炔烃化合物成分可互换以优化配置，R1 既可为目的生物分子，也可以是检测试剂。对于生物素和Alexa Fluor 488，R2 代表目的生物分子。

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图 3.1.1Click-iT铜催化的叠氮炔烃化合物环加成反应适用于检测：A) 核酸、B) 蛋白质、C) 碳水化合物和 D) 脂类。反应物为 A) 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU) 和Alexa Fluor 488 叠氮化物；B) L-高丙氨酸(HPG) 和Alexa Fluor 488 叠氮化物；C) N-叠氮基乙酰半乳糖胺和Alexa Fluor 488炔烃化合物；D) 15-叠氮基十五酸和Alexa Fluor 488 炔烃化合物。在每一种情况下, 前者均是代谢的前体，可通过 新 合成或翻译后修饰掺入蛋白质和核酸。
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图 3.1.2 细胞学分析中常用探测分子的相对大小。因为叠氮和炔烃化合物成分可互换以优化配置，R1 既可为目的生物分子，也可以是检测试剂。对于生物素和Alexa Fluor 488，R2 代表目的生物分子。

无铜 Click 化学

传统的Click 化学是铜离子催化的叠氮-炔烃环加成反应，以标记和检测细胞或组织中的目的分子。如上所述，该方法的一个不足之处是铜离子(包括Cu(II)和抗坏血酸盐或TCEP还原所得的Cu(I))会损伤细胞、减弱荧光团 ref的荧光并损害蛋白质功能。Click-iT DIBO 炔烃试剂(Molecular Probes叠氮和炔烃衍生物 - 表3.1)与非铜催化的Click 化学反应兼容，该反应可捕获或检测到叠氮化物取代的靶标，包括蛋白质代谢类似物和一些蛋白质翻译后修饰的形式(图 3.1.3)。

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图 3.1.3 Click-iT Alexa Fluor 488 DIBO 炔烃与N-叠氮基乙酰半乳糖胺的非铜催化偶联。

非铜催化的Click 化学的关键是DIBO(二苄基环辛炔)，即Click-iT DIBO 炔烃试剂的核心成分。由于八元环应力的存在，该试剂可与叠氮修饰的分子在催化剂、极端温度或溶剂条件下反应，从而使得可以进行肝细胞表面研究，同时避免由铜引发的对经固定细胞和透化细胞中荧光蛋白(如GFP)的损伤。我们共提供九种Click-iT DIBO 炔烃试剂，包括Alexa Fluor DIBO衍生物、四甲基罗明丹和生物素标记，还有可修饰胺基、硫基、羧酸基团的反应探针。 这些试剂具有生物惰性，与叠氮化物的反应产物包含不可逆的共价键，十分稳定。因为叠氮化物和炔烃化合物之间的1,2,3-三氮唑链的共价键十分稳定，可通过多次洗涤来得到高信噪比的信号，这也是检测经固定细胞和透化细胞内靶标时一个十分重要的因素。

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Click-iT叠氮和炔烃标记试剂

虽然对于细胞化学和蛋白生物学而言，生物分子的原位标记可能是Click-iT技术最重要的一项应用，但其实不仅限于此。这些特异性的直接标记方法可应用于生物偶联物的制备、ref 表面和微粒的功能化以及分子的连接。我们的Click-iT叠氮炔烃标记试剂支持此类应用，同时也在为研发新原位标记技术提供了基本工具(Molecular Probes 叠氮和炔烃衍生物 - 表3.1)。

叠氮和炔烃衍生物染料和生物素化试剂

我们提供丰富的 Invitrogen™ Alexa Fluor™和 Oregon Green™以及 Applied Biosystems™叠氮化物和炔烃衍生荧光染料选择，可偶联至互补的叠氮化物和炔烃官能团生物分子：

  • Alexa Fluor 488 叠氮化物 (A10266, 图 3.1.1A)和炔烃化合物 (A10267, 图 3.1.1C)
  • Alexa Fluor 555叠氮化物(A20012) 和炔烃化合物 (A20013)
  • Alexa Fluor 594叠氮化物(A10270) 和炔烃化合物 (A10275)
  • Alexa Fluor 647叠氮化物(A10277) 和炔烃化合物 (A10278)
  • Oregon Green 488叠氮化物(O10180)
  • 四甲基罗明丹 (TAMRA) 叠氮化物(T10182) 和炔烃化合物(T10183)
  • 生物素叠氮化物(B10184)和炔烃化合物 (B10185)

对于叠氮基修饰靶标的非铜催化 Click反应，我们同样提供 Alexa Fluor 594 DIBO 炔烃衍生物：

  • Click-iT Alexa Fluor 594 DIBO 炔烃化合物 (C10407)

如果您在信号放大方面有需要的话，我们将为您提供Oregon Green 488、四甲基罗丹明和Alexa Fluor 488染料的抗体(抗染料和抗半抗原抗体 - 第7.4节)和酪胺信号放大技术(TSA)试剂盒(TSA和其他基于过氧化物酶的信号放大技术 - 第6.2节)。ref 结合使用我们的链霉亲和素或 Invitrogen™ CaptAvidin™ 琼脂糖，生物素叠氮和炔烃试剂将使得免疫印迹的应用和链霉亲和素的富集更加容易 ref(S951, C21386; 亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和 CaptAvidin生物素结合蛋白和亲和基质 - 第7.6节)。

叠氮基和炔烃基修饰的核酸和氨基酸

我们为Click-iT标记实验方案提供以下叠氮基和炔烃基修饰的核酸和氨基酸：

  • 5-乙炔尿苷 (EU, E10345)
  • 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU; A10044, E10187; 图 3.1.1A)
  • Click-iT AHA(用于新生蛋白合成的L-叠氮基高丙氨酸，C10102)
  • Click-iT HPG (用于新生蛋白合成的L-单炔丙基甘氨酸, C10186; 图 3.1.1B)

炔烃基修饰的核苷EdU和EU构成了下述Click-iT细胞增殖和新生RNA分析的基础。独立包装的该试剂提供了体内标记应用所需的较大剂量。ref AHA和 HPG是甲硫氨酸的替代品，从而为35S-甲硫氨酸提供了非放射性的替代物，用于蛋白质合成和降解的脉冲追踪检测。ref

叠氮基和炔烃基修饰的单糖、脂肪酸和萜类

Click-iT代谢糖蛋白标记试剂为检测和表征蛋白质的翻译后糖基化提供了生物合成的前体：ref

  • Click-iT GalNAz代谢糖蛋白标记试剂 (用于标记O-糖蛋白的四乙酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺,C33365; 图 3.1.1C)
  • Click-iT ManNAz代谢糖蛋白标记试剂(用于标记唾液酸修饰的糖蛋白类的四乙酰化 N-叠氮基乙酰半乳糖胺, C33366; 图 3.1.4)
  • Click-IT GlcNAz 代谢糖蛋白标记试剂 (四乙酰化 N-叠氮基乙酰基葡糖胺，用于标记 O-连接 N-乙酰葡糖胺 (O-GlcNAc) 修饰糖蛋白， C33367)
  • Click-iT 海藻糖炔烃化合物 (四乙酰海藻糖炔烃化合物, C10264)

只需将培养细胞与经修饰的糖一起孵育2-3天（或至细胞数目达到合适的密度）。乙酰基团提高了经修饰糖的细胞通透性，被细胞内非特异性脂酶所去除(图 3.1.4)。然后，将所得的叠氮化物或炔烃修饰的糖通过寡糖生物合成途径的放任性质进行代谢掺入，产生的功能化糖蛋白可以化学选择性地偶联互补炔烃或叠氮化物功能化的荧光基团和生物素化试剂，用于检测或亲和捕获。我们还提供 Invitrogen™ Click-iT™ O-GlcNAc 酶标记系统，用于 体外 酶介导的 N-叠氮基乙酰氨基半乳糖胺标记 O-GlcNAc 修饰糖蛋白 ref (C33368，检测蛋白修饰 - 第 9.4 节)，还提供 Invitrogen™ Click-iT™ 蛋白质分析检测试剂盒 (C33370，C33372；检测蛋白修饰 - 第 9.4 节) ，用于检测 1D 或 2D 电泳凝胶或免疫印迹中叠氮化物功能化糖蛋白。

同样，利用叠氮基修饰的萜类和脂肪酸，可以通过胶内荧光扫描、荧光显微镜和流式细胞分析来检测蛋白质翻译后的脂质化。ref 我们提供以下的叠氮基修饰的脂肪酸和萜类：

  • Click-iT法尼醇、叠氮化物
  • Click-iT香叶基香叶醇、叠氮化物(C10249)
  • Click-iT棕榈酸、叠氮化物(15-叠氮基十五酸, C10265; 图 3.1.1D)
  • Click-iT 肉豆蔻酸、叠氮化物(12-叠氮基正十二烷酸, C10268)
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异型双功能试剂

异型双功能试剂适用于第一章和第二章所描述的胺基和硫基反应性标记化学与Click-iT标记实验方案中所描述的适应性叠氮基-炔基反应标记操作程序：

  • 叠氮化琥珀酰亚胺酯
  • 烯丙基琥珀酰亚胺酯
  • 叠氮基碘乙酰胺(I10188)
  • 炔基碘乙酰胺 (I10189)

异型双功能DIBO炔烃试剂提供了修饰胺、硫基和羧酸化合物的工具，从而使得他们可以与经修饰叠氮基一起用于非铜催化的Click 化学反应：

  • Click-iT马来酰亚胺DIBO炔烃化合物 (C10413)

琥珀酰亚胺酯试剂可以用于叠氮基和炔基的功能化含有胺的分子以及含有末端或中心修饰的寡核苷酸类和纳米颗粒。ref

Click-iT反应缓冲液

我们为标记有叠氮基或炔基生物分子的蛋白质和细胞样品提供了 Invitrogen™ Click-iT™ 反应缓冲液试剂盒，从而令您的实验更加得心应手。Click-iT反应缓冲液试剂盒 (C10269) 内有支持50次检测，每次0.5 mL反应体积的足够试剂，可用于后续的流式细胞分析、荧光显微镜和高内涵筛选(HCS)的分析。Click-iT蛋白质反应缓冲液试剂盒 (C10276) 包括了进行Click化学反应偶联功能性蛋白质所需的所有试剂，以便后续标准蛋白质生化分析(例如，免疫印迹或者质谱分析)。

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Click-iT 细胞增殖分析工具

Invitrogen™ Click-iT™ EdU细胞增值检测方法，它是溴脱氧尿苷(BrdU)或3H-thymidine掺入法测定DNA合成的极好替代。ref EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷; A10044, E10187, E10415)是炔基核苷类似物，在细胞生长周期S期被掺入DNA，随后通过Cu(I)催化Click偶联反应耦联叠氮化物衍生荧光基团从而得以检测 ref(图 3.1.1A)。相比于免疫检测BrdU (图 3.1.2)所需的抗体，点击反应偶联荧光基团分子量小，这使得它能有效的穿透进入复杂样本，而无需进行严格的细胞处理，从而大大简化了实验。Click-iT EdU检测的实验方案既适合于贴壁细胞也适合于悬浮细胞。从实验开始到结束，Edu检测仅需90分钟就完成了，而使用基于抗体的Brdu方法，则要花费6-24个小时。此外，Click-iT EdU细胞增殖试剂盒可以与Alexa Fluor染料标记的二抗 ref (二级免疫试剂 - 第7.2节) (图 3.1.5）配合使用，进行表面和细胞内标志物的多重分析。虽然大部分应用于培养的哺乳动物细胞，但Click-iT EdU试剂和方法也可以成功应用于很多模式生物，包括：

  • 大肠杆菌ref
  • 线虫ref
  • 果蝇ref
  • 斑马鱼ref
  • 小鼠ref
  • 植物 ref (紫花苜蓿、拟南芥、葡萄、玉米、水稻和烟草)
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图 3.1.5 使用Click-iT EdU成像试剂盒进行多色成像。使用10 µM EdU处理Muntjac细胞45分钟。然后固定和透化，已经掺入到新合成DNA上的EdU可以利用远红外荧光Click-iT EdU Alexa Fluor 647 HCS检测试剂盒检测到(C10356, C10357)。微管蛋白用抗-微管蛋白抗体进行标记，通过Alexa Fluor 350山羊抗小鼠IgG抗体观察(A21049)。高尔基复合体用绿色荧光染料Alexa Fluor 488标记的凝集素检测，凝集素HPA来源于罗马蜗牛(Helix pomatia)(食用蜗牛)(L11271)。利用抗-过氧化物酶体抗体标记过氧化物酶体，通过黄色荧光Alexa Fluor 555驴抗-兔IgG抗体来观察 (A31572)。

Click-iT EdU流式细胞术检测试剂盒

Invitrogen™ Click-iT™ EdU流式细胞术检测试剂盒提供进行50次0.5mL检测反应的全部试剂，包括核苷类似物Edu和所有用于固定、通透和标记全血样本、贴壁细胞和悬浮细胞的试剂。ref

  • Click-iT EdU Alexa Fluor 488 流式细胞术检测试剂盒(50次检测， C10425；100次检测,  C10420)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 647 流式细胞术检测试剂盒(50次检测， C10424；100次检测,  C10419)
  • Click-iT EdU Pacific Blue 流式细胞术检测试剂盒(50次检测， C10418)

Click-iT EdU成像试剂盒

Invitrogen™ Click-iT™ EdU成像试剂盒提供了可完成50次盖玻片检测的所有组分(每次0.5 mL反应缓冲液)，还包括蓝色荧光Hoechst 33342核染料，此染料用于检测没有掺入EdU的细胞。

  • Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒(C10337)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 555成像试剂盒(C10338)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 594成像试剂盒(C10339)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 647成像试剂盒(C10340)

Click-iT EdU HCS检测试剂盒

Invitrogen™ Click-iT™ EdU HCS检测试剂盒包含进行贴壁细胞96孔板EdU标记和检测反应的全部材料，每次检测100 µL反应缓冲液。

  • Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS检测试剂盒(2块板,  C10350; 10块板,  C10351)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 555 HCS检测试剂盒(2块板,  C10352; 10块板,  C10353)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 594 HCS检测试剂盒(2块板,  C10354; 10块板,  C10355)
  • Click-iT EdU Alexa Fluor 647 HCS检测试剂盒(2块板,  C10356; 10块板,  C10357; 图3.1.5)

对于用于细胞注册或DNA图谱，这些试剂盒还包括可以发出蓝色荧光的HCS NuclearMask Blue染料。

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Click-iT TUNEL检测

TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)检测 - 通过末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)在片段化DNA的3'-羟基端掺入经修饰的dUTP，可能是最广泛的研究凋亡DNA片段化的原位检测方法。对于灵敏且可靠的TUNEL成像检测来说，至关重要的是，经修饰的核苷酸是TDT高效底物。Invitrogen™ Click-iT™ TUNEL成像检测中使用的经微小修饰的EdUTP核苷酸 (图 3.1.6) 能迅速被TDT掺入到DNA中，可将样品迅速固定以便保留晚期凋亡细胞，从而减少由于细胞脱落和后续丢失所导致的假阴性结果。被酶学掺入的核苷酸通过与叠氮化荧光基团耦合的Cu (I) 催化点击偶联反应进行检测。相较掺入染料修饰的核苷酸的一步法，Click-iT TUNEL成像分析法迅速、可靠，在同样条件下，可以在两小时或更少时间内检测到更高比例的凋亡细胞。

Click-iT TUNEL成像分析试剂盒供货时，同时提供叠氮偶联的Alexa Fluor染料供选择，可与其他凋亡检测试剂(细胞凋亡检测 - 第15.5节)配合使用，包括：

  • Click-iT TUNEL Alexa Fluor 488成像检测试剂(C10245)
  • Click-iT TUNEL Alexa Fluor 594成像检测试剂(C10246)
  • Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647成像检测试剂(C10247)

Click-iT TUNEL检测方法已经与各种凋亡诱导试剂（包括星形孢菌素）一起在HeLa、A549和CHO K1细胞中进行了测试，同时亦与基于抗体方法的凋亡标志物(如裂解的多腺苷二磷酸多聚酶(PARP)、Caspase-3、磷酸化组氨酸2B)进行了多重检测。对利用siRNA技术敲除转录因子DEC2的人MCF-7乳腺癌细胞所诱导的凋亡，其亦已证明有明显的检测效果。ref

 
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图 3.1.6 Click-iT TUNEL 成像检测 试剂盒中提供的EdUTP核苷酸

Click-iT RNA和蛋白质合成检测工具

Click-iT RNA试剂盒

Invitrogen™ Click-iT™ RNA HCS及Click-iT RNA成像分析试剂盒可提供检测贴壁细胞内新合成RNA所需的所有组分：

  • Click-iT RNA Alexa Fluor 488 HCS检测试剂(C10327)
  • Click-iT RNA Alexa Fluor 488成像试剂盒(C10329)
  • Click-iT RNA Alexa Fluor 594成像试剂盒(C10330)

对于使用传统荧光显微法或高内涵筛选 (HCS) 法多重分析的全局RNA合成成像来说，Click-iT RNA试剂盒是十分理想的工具。Click-iT RNA试剂盒使用炔基修饰的核苷EU (5-乙炔尿苷, E10345)，将其提供给细胞，使其掺入到新合成RNA中。ref 炔烃标记的小分子使得RNA聚合酶高效利用其进行合成，且几个管家基因的RNA水平无任何明显变化。被掺入的EU通过与叠氮化荧光团耦合的Cu (I) Click偶联反应进行检测。该试剂盒的多重性能使其成为毒性谱分析或使用高内涵成像平台进行疾病模型调查的理想工具。

Click-iT RNA HCS检测试剂盒 (C10327) 提供了2块96孔板每孔50 µL反应体积，用于标记和检测整个细胞新合成RNA所需的足够试剂。该试剂盒同时提供发蓝色荧光的 Invitrogen™ HCS NuclearMask™ Blue Stain作为细胞核复染剂，以获得细胞分界或DNA图谱。Invitrogen™ Click-iT™ RNA成像试剂盒(C10329, C10330)提供了整个细胞新合成RNA所需的足够试剂，可进行25次盖玻片检测，每孔500 µL反应体积。这些试剂盒同时提供发蓝色荧光的Hoechst 33342染料，可作为核染液或用于显示DNA 图谱。

Invitrogen™ Click-iT™ Nascent RNA捕获试剂盒(C10365)使得一个时间段内合成的RNA可被选择性地生物素化，生物素化通过生物素叠氮化物Click偶联来实现。生物素化RNA 随后被链霉亲和素功能化的磁珠捕获以进行逆转录，随后用于DNA测序、PCR或微阵列杂交后续分析。

Click-iT Nascent蛋白合成检测试剂盒

新合成蛋白的检测对于研究蛋白质生物合成、运输、降解的研究人员十分重要。Invitrogen™ Click-iT™ AHA (L-叠氮高丙氨酸）提供了一种快速、灵敏、非放射性的方法，用来替代传统的放射性 35S-甲硫氨酸新生蛋白检测技术。refL-叠氮高丙氨酸，是L-甲硫氨酸的类似物，将其供给培养细胞，通过生物作用掺入进蛋白质。被掺入进去的氨基酸随后可被Cu (I) 催化的click 偶联炔烃衍生荧光团所检测到。此二步标记及检测方法的检测灵敏度可与放射性 35S-甲硫氨酸方法相媲美，且适用于下游的LC-MS/MS 及MALDI-MS分析。Click-iT AHA可作为独立试剂购买(C10102)，也可购买含有该成分的Invitrogen™ Click-iT™ AHA Alexa Fluor 488蛋白合成HCS分析试剂盒(C10289)，其中试剂盒含有检测用Alexa Fluor 488 炔烃。Click-iT AHA已经过验证，在许多细胞类型中都可成功替代甲硫氨酸，包括COS-7、3T3-L1、HeLa、HEK 293及Jurkat细胞。由于甲硫氨酰tRNA转移酶更偏爱使用甲硫氨酸作为底物，Click-iT AHA细胞合成利用应当在无甲硫氨酸的培养基中进行，并应当用补充培养基(如无甲硫氨酸DMEM细胞培养基)替代HBSS以使Click-iT AHA在较低的浓度下能被更多地合成利用。

Click-iT 脂质过氧化检测工具

Invitrogen™ Click-iT™ 脂质过氧化成像试剂盒 (C10446) 采用点击化学和炔烃修饰亚油酸 (亚油酸酰胺炔或 LAA) 来检测通过荧光显微镜法 (图 3.1.7) 或高内涵筛选脂质过氧化物衍生的蛋白修饰。与细胞共同孵育时，Click-iT LAA 会掺入到细胞膜中。脂质过氧化后，LAA 发生氧化反应，生成 9-氢过十八碳二烯酸和 13-氢过十八碳二烯酸 (HPODE)。这些氢过氧化物分解为 α,β-不饱和醛，后者易于修饰亲核侧链的蛋白，产生含炔烃的蛋白，然后使用点击化学法通过荧光或生物素化叠氮化物检测。

Click-iT 脂质过氧化成像试剂盒 (C10446) 提供了使用绿色荧光 Alexa Fluor 488 叠氮化物显示脂质过氧化修饰所需的工具。为定制点击反应，我们还提供各种叠氮化物修饰的检测试剂和 Click-iT 细胞反应缓冲液试剂盒 (C10269，参见上文)。

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图 3.1.7 血红素处理细胞中的脂质过氧化检测。在完全生长培养基中的 50 µM LAA (在 Click-iT 脂质过氧化试剂盒 (C10446)) 中培养 30 分钟后，使用 10 µM 血红素处理牛肺动脉内皮细胞 (BPAE)，以诱导脂质过氧化衍生的蛋白质修饰 (右)，或在 37°C 下维持未处理 (左) 2 小时，然后固定和破膜。用 5 μM Alexa Fluor 488 叠氮化物进行点击反应 30 分钟 ，使用 NucBlue 活细胞染色剂 (R37605) 进行细胞复染，并使用 Zeiss Axiott 倒置显微镜40x 物镜成像。

数据表

有关列标题的详细说明，请参阅 数据表内容的定义

货号MW储存可溶绝对值ECEm溶剂注
A10044
EdU		252.23F,DDMSO, H2O<300 无 1
A10266
Alexa Fluor 488 叠氮化物		861.04F,D,L二甲基亚砜49376,000516pH 7 
A10267
Alexa Fluor 488 炔烃		773.91F,D,L二甲基亚砜49476,000520pH 7 
A10270
Alexa Fluor 594 叠氮化物		948.16F,D,L二甲基亚砜590105000617pH 7 
A10275
Alexa Fluor 594 炔烃		962.23F,D,L二甲基亚砜588100,000616pH 7 
A10277
Alexa Fluor 647 叠氮化物		约850F,D,L二甲基亚砜646270,000668MeOH 
A10278
Alexa Fluor 647 炔烃		约800F,D,L二甲基亚砜646250000661pH 7 
炔烃，SE225.20F,D二甲基亚砜<300 无  
叠氮基 (PEO)4 丙酸，SE388.38F,D,L二甲基亚砜<300 无  
A20012.
Alexa Fluor 555 叠氮化物		约850F,D,L二甲基亚砜554151000568pH 7 
A20013
Alexa Fluor 555 炔烃		约750F,D,L二甲基亚砜554150000567pH 7 
B10184
生物素叠氮化物		615.79F,D,L二甲基亚砜<300 无  
B10185
生物素炔烃		528.66F,D二甲基亚砜<300 无  
C10102
Click-iT AHA		258.16F,DD二甲基亚砜<300 无  
C10186
Click-iT HPG		127.14F,D二甲基亚砜<300 无  
Click-iT法尼醇、叠氮化物263.38F,D,LL二甲基亚砜<300 无  
C10249
Click-iT香叶基香叶醇、叠氮化物		331.50F,D,LL二甲基亚砜<300 无  
C10264
Click-IT 岩藻糖炔烃		342.30F,D二甲基亚砜<300 无 2
C10265
Click-iT 棕榈酸，叠氮化物		283.41F,D,L二甲基亚砜<300 无  
C10268
肉豆蔻酸，叠氮化物		241.33F,D,L二甲基亚砜<300 无  
C33365
Click-iT GalNAz 代谢糖蛋白标记试剂		430.37F,D二甲基亚砜<300 无 3
C33366
Click-iT ManNAz 代谢糖蛋白标记试剂		430.37F,D二甲基亚砜<300 无 3
C33367
Click-iT GlcNAz 代谢糖蛋白标记试剂		430.37F,D二甲基亚砜<300 无 3
E10345
欧盟		268.23F,D二甲基亚砜<300 无  
I10188
碘乙酰胺叠氮化物		310.14F,D,L二甲基亚砜<300 无 4
I10189
碘乙酰胺炔烃		223.01F,D,L二甲基亚砜<300 无 4
O10180
Oregon Green 488 叠氮化物		637.68F,D,L二甲基亚砜49480,000521pH 95
Oregon Green 488 炔烃449.37F,D,L二甲基亚砜49480000521pH 95
T10182
TAMRA 叠氮化物		554.65F,D,L二甲基亚砜54695000571MeOH6
T10183
TAMRA 炔烃		467.52F,D,L二甲基亚砜54395,000572MeOH6
  1. E10187 和 E10415 是 A10044 的替代容器，但其他容器相同。
  2. C10264是体内脱乙酰基生成的海藻糖6-乙炔类似物 (分子量为 174.15).
  3. C33365、C33366 和 C33367 在体内去乙酰化，分别产生 N-叠氮基乙酰基半乳糖胺、N-叠氮基乙酰基甘露糖胺和 N-叠氮基乙酰葡萄糖胺 (所有 MW = 262.22)。
  4. 溶液中的碘乙酰胺经过快速光解作用成为惰性产物，在实验反应前尽量减少曝光。
  5. Oregon Green 488 染料的吸收及荧光只在适度的酸溶液 (pH <5)中具有pH依赖性。
  6. 与甲醇相比，溶解在pH为8的缓冲液中的四甲基罗丹明染料，其吸收与发射峰移了大约8 nm，EC降低了约10%。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。