硫醇修饰和检测简介—第  2.1 节

页面内容

• 硫醇反应探针的常见应用
• 硫醇基团的反应性
• 碘乙酰胺
• 马来酰亚胺
• 可逆硫醇反应性试剂
• 硫醇定量试剂
• 数据表格
• 订购信息

标记蛋白和核酸

硫醇反应性染料主要用于标记蛋白，用于检测构象变化、多亚基复合物的组装以及配体结合过程。对于蛋白和肽，硫醇反应性探针的主要靶标是半胱氨酸残基。在哺乳动物蛋白中，半胱氨酸靶标的出现频率 (3.3%) 低于赖氨酸靶标 (7.2%) 的一半，其使用荧光基团及其胺反应性衍生物—第 1 章中所述的胺反应性试剂标记。一些蛋白和多肽只有单个半胱氨酸残基，可以使用硫醇反应性探针进行位点特异性标记。在具有多个半胱氨酸残基的蛋白中，多样性通常足够小，因此可以通过位点定向诱变获得单个半胱氨酸变体，而不会显著破坏天然蛋白的结构或功能。在偶联物的活性或结合亲和力至关重要的应用中，位点特异性修饰对于小蛋白标记特别重要；在这种情况下，硫醇反应性标记是优于胺反应性标记的首选方法。

半胱氨酸残基丰度相对较低也使得实现饱和修饰成为可能，同时降低导致蛋白沉淀和荧光自淬灭相互作用的风险，从而使高百分比胺反应性修饰在很大程度上无法实现。然而，在含有多个半胱氨酸残基的蛋白中，单个半胱氨酸的反应性很大程度上取决于其局部环境和反应性染料的疏水性。开发了涉及位点定向半胱氨酸突变、硫醇反应性和官能团保护/脱保护的位点特异性修饰策略，以使用供体和受体染料对蛋白进行双标记，用于荧光共振能量转移 (FRET) 应用（荧光共振能量转移 (FRET)——注释 1.2）。硫醇反应性染料也可与巯基化寡核苷酸反应，用于基于杂交或连接的核酸检测应用，并与硫尿苷修饰的 tRNA 反应，以研究其与蛋白合成机制的结合。

可衍生低分子量分子

本章中所述的几种硫醇反应性探针也可用于衍生低分子量硫醇，以用于采用色谱和电泳分离的各种分析检测。Shimada 和 Mitamura 的一篇详尽综述介绍了使用我们的几种硫醇反应性试剂对含硫醇化合物进行衍生的情况。

定量硫醇

硫醇在维持蛋白、细胞和生物体的适当氧化还原状态方面起着主要作用。然而，硫醇对氧化的敏感性可导致形成二硫化物和更高的氧化产物，通常会导致生物活性损失。通过细胞中高浓度的还原型谷胱甘肽，测量活细胞中硫醇的氧化状态变得复杂，这使其难以使用与硫醇发生化学计量反应的试剂进行检测（细胞粘附、趋化性、多药耐药性和谷胱甘肽探针 - 第 15.6 节）。尽管如此，已经开发出许多有用的试剂和方法用于硫醇和二硫化物的定量测定。

使用 DTT 或 TCEP 还原二硫化物

在蛋白中，硫醇基团（也称为硫醇或巯基）存在于半胱氨酸残基中。硫醇也可以通过用试剂如二硫苏糖醇 (DTT, D1532) 或 2-巯基乙醇（β -巯基乙醇）选择性地还原胱氨酸二硫化物产生，然后在与硫醇反应性探针反应之前，必须通过透析或凝胶过滤去除每种试剂。

DTT 或 2-巯基乙醇的去除有时会伴随着硫醇在空气中重新氧化为二硫化物。使用还原剂三-（2-羧乙基）膦 (TCEP, T2556) 通常可以避免二硫键的重新形成，因为它不含硫醇，所以在进行硫醇修饰之前通常不需要去除（图 2.1.1）。然而，有几份报告表明 TCEP 可以在某些条件下与卤乙酰胺或马来酰胺反应，并且在存在 TCEP 的情况下会抑制标记。在硫酸铵沉淀的蛋白上进行硫醇反应性标记有助于在制备还原步骤后高效、快速地去除 DTT，并在后续标记反应中抑制硫醇的重新氧化。

TCEP 在较高的 pH 值和较高的温度下比 DTT 更稳定，在不含金属螯合剂（如 EGTA）的缓冲液中可保持更长的时间；DTT 在含有金属螯合剂的溶液中比 TCEP 更稳定。此外，TCEP 在 Ni²⁺ 水平下也更加稳定，Ni2+ 通常会污染从 Ni²⁺ 亲和柱洗脱的蛋白，并迅速氧化 DTT。TCEP 的离心标记比 DTT 的离心标记更稳定两至四倍，这是电子顺磁共振 (EPR) 光谱的优势。此外，TCEP 还用于稳定抗坏血酸溶液。TCEP 通常不能渗透细胞膜和疏水性蛋白核心，因此可以用于选择性还原水环境中的二硫化物。还有报告称，在蛋白质组学分析之前，TCEP 可用于去除高丰度血浆蛋白（白蛋白、转铁蛋白等），因为这些蛋白具有大量的二硫键，因此特别容易发生还原变性。

图 2.1.1 使用 TCEP（三-（2-羧乙基）膦，盐酸盐；T2556）还原二硫化物。与 DTT（二硫苏糖醇，D1532）不同，TCEP 本身不含硫醇，因此下游硫醇标记反应不需要对还原试剂进行初步去除。

硫醇反应性试剂

主要硫醇反应性试剂，包括碘乙酰胺、马来酰亚胺、苄基卤化物和溴甲基酮，通过硫醇的 S-烷基化反应生成稳定的硫醚产物。诸如 NBD 卤化物等芳基化试剂可通过亲核试剂取代芳香族卤化物，与硫醇或胺发生反应。由于硫醇根阴离子比中性硫醇具有更好的亲核性，半胱氨酸在 p_Ka（~8.3，取决于蛋白结构环境）以上的反应性更强。然而，当通过琥珀酰亚胺酯（荧光基团及其胺反应性衍生物 - 第 1 章）修饰胺时，试剂稳定性也会随 pH 值的增加而降低（例如马来酰亚胺水解为非反应性马来酰亚胺酸；参见下文），因此 7.0–7.5 的折衷 pH 值通常用于蛋白修饰反应。有报告称，含有细胞内蛋白的碘乙酰胺和马来酰亚胺加合物具有不同程度的稳定性和毒性。HEK 293 细胞中卤乙酰和马来酰亚胺基硫醇反应性探针的细胞内反应性和毒性分析表明马来酰亚胺稳定性较差，碘乙酰胺毒性较高（推测因为马来酰亚胺加合物在能够触发损伤信号转导通路之前被降解）。

也可提供用于可逆硫醇修饰的 TS-Link 系列试剂（可见光激发的硫醇反应性探针 - 第 2.2 节）。TS-Link 试剂是水溶性硫代硫酸盐，可与硫醇发生化学计量反应，形成混合二硫化物。

硫醇还与荧光基团及其胺反应性衍生物—第 1 章中描述的许多胺反应性试剂发生反应，包括异硫氰酸盐和琥珀酰亚胺酯。然而，反应产物似乎不够稳定，可用于蛋白中硫醇的常规修饰。尽管硫醇 - 异硫氰酸酯产物（二硫氰酸酯）可与相邻胺反应产生硫脲，但二硫代硫酸酯更容易与水反应，消耗反应性试剂而不形成共价加合物。

除了通过位点定向突变插入或删除半胱氨酸残基外，还开发了多种试剂，用于将硫醇引入蛋白、核酸和脂质中。由于硫醇的选择性引入对于交联两种生物分子尤为重要，因此在交联和光活化试剂—第 5 章中讨论了这些试剂。

使用硫醇反应性试剂进行位点特异性标记

据报告，一种对含有至少一个邻二醇和另一个远端硫醇的蛋白进行位点特异性双标记的方法。在本标记方案中，首先用苯丁二醇 (PAO) 保护邻苯二醇，以便用 Oregon Green 488 马来酰亚胺（O6034，可见光激发的硫醇反应性探针—第 2.2 节）标记未受保护的远端硫醇。然后用二硫苏糖醇 (DTT) 去保护封闭的邻二醇，并用 Alexa Fluor 350 马来酰亚胺（A30505，紫外光激发的硫醇反应探针 - 第 2.3 节）进行标记。可能需要对靶蛋白进行设计以包含邻二醇和远端硫醇，以便采用这种标记策略。

在类似的双硫醇标记方法中，不使用 PAO 保护/脱保护，而是使用 FlAsH-EDT₂ 试剂（T34561，可见光激发的硫醇反应性探针 - 第 2.2 节）标记蛋白的四半胱氨酸标签，并使用 Alexa Fluor 568 马来酰亚胺（A20341，可见光激发的硫醇反应性探针 - 第 2.2 节）标记远端半胱氨酸。然后使用 FlAsH 标签和 Alexa Fluor 568 染料之间的荧光共振能量转移（荧光共振能量转移 (FRET) - 注释 1.2）检测 SF9 细胞中 β₂-肾上腺素受体 C 端结构域的配体诱导构象变化。

碘乙酰胺容易与所有硫醇（包括在肽、蛋白和硫醇化多核苷酸中发现的硫醇）发生反应，形成硫醚（图 2.1.2）；它们比溴乙酰胺反应性更强。当蛋白的半胱氨酸残基被封闭或缺失时，碘乙酰胺有时可能与蛋氨酸残基发生反应。它们也可能与组氨酸或酪氨酸反应，但通常仅在不存在游离硫醇的情况下才会发生反应。虽然碘乙酰胺可以与游离碱基形式的胺反应，但大多数脂肪胺（蛋白 N 端的 α-氨基除外）被质子化，因此在 pH 值低于 8 时相对不反应。此外，碘乙酰胺可与硫代寡核苷酸引物以及硫代磷酸酯发生反应。

碘乙酰胺在光下本质不稳定，尤其是在溶液中；因此应在弱光下进行反应。向反应混合物中添加半胱氨酸、谷胱甘肽或巯琥珀酸会淬灭硫醇反应性探针的反应，形成可通过透析或凝胶过滤轻松去除的高水溶性加合物。尽管碘乙酰胺与蛋白硫醇反应时形成的硫醚键非常稳定，但生物偶联物在氨基酸水解过程中失去其荧光基团，产生 S-羧甲基半胱氨酸。

图 2.1.2 硫醇与烷基卤化物的反应。

马来酰亚胺是用于硫醇选择性修饰、定量和分析的出色试剂。在该反应中，硫醇添加到马来酰亚胺的双键上，生成硫醚（图 2.1.3）。这些 N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 的荧光和显色类似物的应用与碘乙酰胺的应用强烈重叠，尽管马来酰亚胺显然不与蛋氨酸、组氨酸或酪氨酸发生反应。马来酰亚胺与胺的反应通常需要比马来酰亚胺与硫醇的反应更高的 pH 值。

马来酰亚胺水解成非反应性产物可与硫醇修饰显著竞争，特别是在 pH 值高于 8 时。此外，一旦形成，马来酰亚胺衍生的硫醚可水解为琥珀酰亚胺加合物的异构混合物，或者它们可与相邻胺进行环化以产生交联产物。后一种反应比前一种反应的频率低得多。水解琥珀酰亚胺的蓄意加速到琥珀酰亚胺酸环开启反应，通过钼酸盐或铬酸盐催化进行，为降低马来酰亚胺衍生化硫醇的生物偶联物的异质性提供了一种策略。

图 2.1.3 硫醇与马来酰亚胺的反应。

我们的几种硫醇反应性探针可用于形成可逆键，包括 BODIPY FL L-胱氨酸 (B20340) 以及 TS-Link BODIPY 硫代硫酸盐和 TS-Link DSB-X 生物素 C₅ - 硫代硫酸盐试剂（可见光激发的硫醇反应性探针—第 2.2 节，生物素化和半抗原化试剂—第 4.2 节）。

BODIPY FL L-胱氨酸等对称二硫化物会发生硫醇-二硫键互换反应，产生新的不对称二硫化物（图 2.1.4），这是一种可自由逆且具有硫醇特异性的反应。这种二硫键可以用 DTT 或 TCEP 等试剂进行裂解。

硫甲磺酸盐 (R–S^–SO3–)，包括我们的水溶性 TS-Link 试剂，与二硫化物相似，因为它们可与硫醇发生化学计量反应形成二硫化物（图 2.1.5）。然而，与 BODIPY FL 胱氨酸探针与游离硫醇的反应不同，不需要过量的 TS-Link 试剂来驱动平衡。

图 2.1.4 硫醇与对称二硫化物的反应。

图 2.1.5 TS-Link 试剂 (R1) 与硫醇 (R2) 的反应，然后用还原剂去除标记。

Measure-iT 硫醇检测试剂盒

Measure-IT 巯基检测试剂盒 (M30550) 提供了一种简单、准确的硫醇定量方法。这种硫醇测定法的线性范围为 0.05–5 μM 硫醇（图 2.1.6），其灵敏度比基于 Ellman 试剂的比色法高出 400 倍。

每个 Measure-IT 硫醇检测试剂盒包含：

• Measure-IT 硫醇定量试剂（1,2-丙二醇 100X 浓缩液）
• Measure-IT 硫醇定量缓冲液（50 mM 磷酸钾缓冲液）
• Measure-iT 硫醇定量标准（还原谷胱甘肽）
• 详细方法（Measure-iT 硫醇检测试剂盒）

只需将试剂按 1:100 的比例稀释，将 100 μL 装入微孔板的孔中，添加 1-10 μL 样品量，混合，然后读取荧光。可在 5 分钟内达到最大荧光信号，并可保持稳定至少 1 小时。该检测在室温下进行，并且常见污染物在检测中耐受性良好。Measure-IT 硫醇检测试剂盒基于 96 孔微孔板形式的 100 μL 检测体积，可提供 500 次检测所需的材料；该硫醇检测试剂盒也可用于比色皿或 384 孔微孔板。

图 2.1.6 Measure-IT 硫醇检测的线性和灵敏度。使用 Measure-IT 硫醇检测试剂盒 (M30550) 对三份 10 μL 谷胱甘肽样品进行分析。使用 490/520 nm 的激发/发射波长测量荧光，并绘制出与谷胱甘肽浓度的关系曲线。重复样品的变异 (CV) 为 <2%。

硫醇和硫化物定量试剂盒

使用硫醇和硫化物定量试剂盒 (T6060) 可实现蛋白和非蛋白硫醇进行超灵敏比色定量。在该检测中，基于 Singh 报告的方法，硫醇或硫化物还原二硫化物抑制的木瓜蛋白酶衍生物，并且以化学计量方式释放活性酶（图 2.1.7）。然后，通过分光光度检测 412 nm 处的 p-硝基苯胺释放量，使用显色木瓜蛋白酶底物 L-BAPNA 测定酶活性。

虽然也可以使用 5,5'-二硫双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB 或 Ellman 试剂，D8451）对硫醇和无机硫化物进行定量，但硫醇和硫化物定量试剂盒中的酶促扩增步骤使研究人员能够检测低至 0.2 纳摩尔的硫醇或硫化物—其灵敏度比使用 DTNB 获得的灵敏度高出约 100 倍。通过将二硫化物胱氨酸掺入反应混合物中，可以间接检测蛋白中的硫醇。胱胺与蛋白硫醇发生交换反应，生成 2-巯基乙胺（半胱胺），然后释放活性木瓜蛋白酶。被马来酰亚胺、碘乙酰胺或其他试剂烷基化的硫醇不属于检测范围，因此可以进行减量测定。

硫醇和硫化物定量试剂盒包含：

• 木瓜蛋白酶–SSCH₃，二硫化物抑制的木瓜蛋白酶衍生物
• L- Bapna，一种显色木瓜蛋白酶底物
• DTNB（Ellman 试剂），用于校准检测
• 胱胺
• L-半胱氨酸，一种硫醇标准品
• 缓冲液
• 测定硫醇、无机硫化物和马来酰亚胺的详细方法（硫醇和硫化物定量试剂盒） 

所提供的试剂足够使用标准 1 mL 比色皿进行约 50 次测定或使用微孔板形式进行 250 次测定。

图 2.1.7 使用硫醇和硫化物定量试剂盒 (T6060) 检测硫醇的化学基础：A) 木瓜蛋白酶的非活性二硫衍生物木瓜蛋白酶–SSCH₃ 在存在硫醇的情况下活化；B) 活性木瓜蛋白酶裂解底物 L-Bapna，释放 p-硝基苯胺发色团；C) 蛋白硫醇通常难以接近，与胱胺交换以生成 2-巯基乙胺（半胱胺），其功能等同于步骤 A 中的硫醇 R-SH。

用于定量硫醇的 Ellman 试剂 (DTNB)

Ellman 试剂（5,5'-二硫双-（2-硝基苯甲酸）或 DTNB；D8451) 仍然是一种利用分光光度法对蛋白硫醇进行定量以及扩展分析硫醇-二硫化物交换反应和氧化硫醇修饰的重要试剂。它很容易与硫醇形成混合二硫化物，释放出发色团 5-巯基-2-硝基苯甲酸（最大吸收值为 410 nm，EC 值为 ~13,600 cm^-1M^-1）。只有可接触到这种水溶性试剂的蛋白硫醇才能进行修饰。硫醇通常可在存在 6 M 胍氯化物的情况下进行滴定来进行定量分析。谷胱甘肽和其他硫醇的 DTNB 偶联物可通过 HPLC 分离并根据其吸收情况进行定量。

用于定量硫醇的其他荧光测定试剂

几种马来酰亚胺——包括 7-二乙氨基-3-（4'-马来酰亚胺基苯基）-4-甲基香豆素（CPM, D346；紫外光激发的硫醇反应性探针 - 第 2.3 节）和 N-（7-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-基）马来酰亚胺（DACM, D10251；紫外光激发的硫醇反应性探针 - 第 2.3 节）——在与硫醇结合后才会发出明显的荧光，因此可用于硫醇定量。同样，荧光素-5-马来酰亚胺（F150，可见光激发的硫醇反应性探针 - 第 2.2 节）在与硫醇反应后，显示出对分析有用的 10 倍荧光增强。单溴二胺（M1378，M20381；紫外光激发的硫醇反应性探针—第 2.3 节）在与硫醇发生反应前基本上不发荧光，可用于测定细胞中的硫醇水平。

此外，本章中的大多数荧光硫醇反应性试剂可用作衍生化试剂，通过利用分离步骤的 HPLC 等技术分析硫醇。5-（溴甲基）荧光素是该应用中具有最大内在灵敏度的试剂。有关定量细胞中还原型谷胱甘肽的方法的进一步讨论，请参见细胞粘附、趋化作用、多药耐药性和谷胱甘肽探针 - 第 15.6 节。

有关列标题的详细说明，请参阅数据表内容的定义