全光谱流式细胞术实验对照和样本处理

在此我们讨论了光谱流式实验对照和样品制备，包括标记方案、生物学和技术控制。这是配色方案设计后光谱流式实验流程的下一步骤 (图 1)。

探索光谱流式分析试剂光谱流式细胞术实验配置

光谱重叠

本页内容

确定目标靶标的标记方案
试剂滴定
生物控制
技术控制

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图1.流式细胞术实验过程概图。

确定感兴趣靶标的标记方案

用于检测、实验方案设计以及最终实验样品采集的缓冲液系统应相同，以与缓冲液对所评估样品和抗体的任何影响保持一致。为制备和处理样品以及进行抗体染色步骤所选择的缓冲系统和方案在很大程度上取决于细胞需求和目标抗原，从而被选择用于优化检测并减少非特异性结合。据认为，非特异性结合的一个常见原因是通过抗体的 Fc 部分与许多免疫细胞亚群表达的 Fc 受体结合。为了规避这一问题，可以在对细胞进行染色之前使用纯化免疫球蛋白 G (IgG) 或血清等试剂。研究人员还可以使用 Fc 封闭试剂，这种封闭试剂将与 Fc 受体结合。最后，为防止用巨噬细胞和单核细胞观测的非特异性结合，专门配制了细胞封闭试剂通常用于提高细胞群的分离度。

使用抗体标记细胞的具体步骤取决于实验问题。流式细胞术的大量应用需要个性化标记策略，并且应该是实验方案的组成部分。然而，可能适用于所有类型标记的考虑因素包括最佳标记条件、试剂标记顺序和固定。值得注意的是，固定会影响荧光强度以及自发荧光 [1]。

了解更多信息：流式细胞术实验方案

试剂滴定

在中间实验之前，一个关键步骤是，通过滴定过程确定目标样品的每种流式抗体的最佳染色浓度 [2]。滴定涉及使用一系列抗体稀释液对样品进行染色，以确定阳性信号和背景之间实现极佳分离的浓度。抗体浓度过低会使对目标细胞的标记不足，并且会损害对表达低水平抗原的细胞的检测，而抗体浓度过高会增加阴性细胞的背景。同样还应该对任何功能或活性试剂进行滴定，以确定其最佳使用浓度。最好首先滴定细胞活性试剂，然后使用最佳浓度的活性试剂进行抗体滴定 [3]。在某些情况下，抗体生产商提供建议浓度，可以用作滴定的起点。滴定后，可根据稀释系数计算染色指数或分离指数。这将显示饱和滴度，即在抗体增加而信号强度不增加的情况下的抗体浓度 (图 2)。重要的是，这一过程应一次进行一种抗体，且采用尽可能接近计划实验系统的条件（即组织和细胞类型、细胞活化水平、孵育时间、缓冲液类型、反应体积和温度）。抗体经过逐个评估后，就需要进行评估和进一步优化，以便在配色方案中使用。

Human lymphocytes stained with CD3-Alexa Fluor 647 titration and stain index

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图2.抗体滴定和染色指数。将 CD3/CD28 Alexa Fluor 647 经递增的稀释度稀释，用于染色人淋巴细胞，级联数据显示于 (A) 中，首先显示未染色的样品。(B) 计算染色指数以确定阳性和阴性细胞群的最佳分离，并确定染色指数最高的位置。

了解更多信息：BioProbes 79：多参数流式细胞术最佳实践

生物控制

为验证实验成功从而令人置信任何所观测变化都是在测变量所致，实验对照（通常称为生物对照）是必要的。生物对照不同于技术对照，例如单染样品，为适当仪器设置和数据判读所必需。有两种类型的对照：

阳性生物对照：阳性生物对照由可产生所需实验结果或已知表达目标抗原的样品组成。在某些情况下，样品可能需要用某种已知能够诱导所需反应的试剂来进行处理，样品也可能是已知表达蛋白质的替代组织或细胞类型。这种生物阳性对照有助于确定确定流式细胞术实验中的“阳性”情况。
阴性生物对照: 阴性生物对照可能是经过或未经过赋形剂溶液处理的细胞，可能是已知不表达目标靶标的组织或细胞，也可能是来自已知健康受试者的样品。请注意，阳性和阴性对照表明只有两种可能的结果。然而，生物系统很复杂，因此结果可能会有分级。在某些情况下，设置基准的对照可能更合适，且将处理过的样品与基准进行简单比较。当研究的目标是确定蛋白表达是否发生变化 (如上调或下调)，这尤其相关 [4]。

技术控制

技术对照用于帮助调整检测器设置，生成分离矩阵，并设置阳性表达的边界。技术对照包括未染色细胞、单染对照、二抗对照、同种型对照和荧光减一 (FMO) 对照。此类技术对照样品对于流式细胞分析至关重要，因为它们有助于确保这种工具的完整性，并且有助于结果的准确解读。建议一起处理这些对照与生物样品。

未染色细胞：需要未染色的细胞对照用于测定细胞自发荧光以及设置前向和侧向散射参数。自发荧光在细胞类型之间存在光谱范围和强度的差异，并在细胞老化时、被处理、活化或固定时发生变化。重要的是，使用的未染色细胞对照反映细胞状况并与实验样品相匹配。分离算法使用未染色细胞对照，可以从其余光谱特征中分离并提取自发荧光的光谱贡献，从而提高信号分辨率。建议将未染色的细胞对照用于实验中的每种细胞类型和处理。
单染对照：所有成功多参数流式细胞术实验都需要一组优质的单染对照。在传统流式细胞术中，单染对照提供了必要信息，以计算每个荧光染料溢入非主检测器的数量，并通过补偿过程纠正这种溢漏。在光谱流式细胞术中，分离过程利用一种算法确定每个荧光染料的贡献，将这种光谱特征用于每个单染样本 [1]。仅使用一种抗体对细胞或捕获微球进行染色，制备单染对照。应同时检测细胞和微球，以确定哪种对照能够为分离提供最准确的荧光染料光谱特征。拥有高质量的单染对照是任何实验成功分离的先决条件。无论是使用细胞还是微球，都有四个适用于单染对照的规则 [4]。
- 1.在一个单染中，阳性和阴性必须具有相同的自发荧光。例如，两个细胞群都应是相同类型的微球，或者两个细胞群都应是相同类型的细胞。如果阳性和阴性的自发荧光不匹配，则会引入错误，分解后会显示该错误。
- 2.单染对照的阳性信号与实验样品相比必须像一样明亮或更亮。
- 3.单染对照必须使用与全实验样品完全相同的荧光染料；对于串联染料，建议使用非常相同批次的串联染料，以避免降解和批次间差异。
- 4.所有单染对照应与实验样品以相同的方式进行处理，包括固定、洗涤和储存。由于细胞在不同细胞类型之间因光谱范围和强度各不相同，且当细胞老化时、被处理、活化或固定时会发生变化，可使用与实验样品相同的细胞类型和样品制备单染对照。

二抗对照：当一抗未结合时，就需要通过间接染色程序进行二抗对照。它有助于确定是否单独因二抗发生任何非特异性结合。观察到任何高于背景的信号都会导致非特异性染色。
同种型对照：同种型对照是一种为抗某种抗原而生成的抗体，在所分析细胞类型或样品中这种抗原没有表达。要获得数值的同型对照，就需要与比较者抗体的物种、免疫球蛋白类别、亚类和轻链匹配。此外，需要将其结合到与实验抗体结合到相同的荧光染料上。如果遵循这些严格参数，那么同种型对照也许能够证明包括 Fc 受体结合和内源性酶在内的多种来源的非特异性背景贡献。然而，即使大多数同种型对照和目标抗体的固有特性一致，但浓度、聚集程度和荧光染料与抗体比的差异性也可能影响同种型对照代表的真实阴性值，同种型对照应该不是用于评估背景或非特异性染色的唯一对照 [5]。
荧光减一 (FMO) 对照 (多色实验对照)：FMO 对照是用多参数实验方案中使用的所有荧光试剂染色的细胞样本，除了一种。随着流式细胞术中使用的荧光染料数量的增加，荧光溢漏校正和信号测量的固有误差都有助于扩散。为了区分真实信号和扩散，特别是对于具有连续表达模式的蛋白质，可以使用荧光减去一 (FMO) 对照 (表 1)。

表 1.FMO 对照。

FMO 对照		目的
用所有荧光染料染色的细胞，除一种荧光染料外。		将扩散鉴定为溢漏的荧光染料特征
基于扩散的门控定位		对具有低表达或可变表达水平的靶标至关重要

FMO 对照确定因扩散和阳性细胞群所致背景信号之间的截止点，从而辅助门控设置 (图 3)。

Plot displaying APC and PE Texas Red with and without FMO Control

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图 3.荧光减一 (FMO) 对照。双参数图显示了 IFNγ-APC 和 CD4 PE-Texas 的组合，而来自更大免疫表型分析实验方案的红色抗体偶联物显示 (A) 未染色细胞、(B) FMO 对照 (包含完整配色方案中的所有抗体偶联物，除 IFNγ-APC 外）以及 (C) 完整配色方案染色。IFNγ-APC 阳性表达的边界由 FMO 对照确定，考虑了阴性的扩散，以便正确识别 IFNγ β 阳性群体。

FMO 对照优于未染色细胞和单染对照，因为它们考虑到实验中使用的有助于扩散的所有其他荧光染料的影响。由于对照数量庞大，可能需要非常大的配色方案，请务必记住：在表达偏低的二级和三级组中，或者在表达连续性导致确定阳性与阴性之间存在困难时，FMO 对照对于抗原极有价值。

有一种改良型 FMO 对照，可用于研究试剂的某些添加或组合，它们可能对背景、扩散和群体分辨率产生影响。它被称为 FMX 对照，其中细胞样品经荧光试剂亚组染色，x 代表样品中溢漏了的荧光染料。这也可以设置为将一个大的实验方案分成几个较小的配色方案，以研究配色方案中多种抗体的效果，揭示潜在不必要的相互作用，或确定特定的染色序列是否影响信号分辨率。

下一步行动方案

全光谱流式细胞术基础理论