光谱流式配色方案设计

在进行抗原分类并确定设门策略后 (请参阅流式细胞术实验流程) 后，在设计配色方案时需要选择合适荧光染料，并将荧光染料与抗原标志物进行配对，以识别各种细胞亚群并检测目标抗原 (图 1)。为了方便浏览，可将流式试剂整理成表格，以快速参考荧光染料分配情况，查看荧光染料的最大发射波长以及预测潜在的共同激发和扩散水平 (表 1)。

表 1.荧光染料表。按主要激光器和发射光波峰列出的常见荧光染料。激发波峰和发射波峰都非常相似的荧光染料列在一起 (如 PE 和 Alexa Fluor 561)。将荧光染料与指标进行配对时，使用这样的表格很有帮助。

可用的流式试剂可在供应商目录中在线查找，也可在试剂数据库或 流式在线配色 工具的帮助下进行查看。复杂的流式配色工具可动态连接到流式试剂数据库，并可根据靶标选择、抗原密度信息和荧光染料的亮度进行方案调整。这些工具可以节省时间和避免选择不兼容的荧光染料，从而帮助指导用户完成流式实验方案设计。一些仪器提供基于所用特定配置的整合式光谱查看器 (图 2)。为扩大试剂选择范围，可以使用 标记试剂盒 或通过供应商的 定制化抗体服务计划制备流式抗体。

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图2.精选 30 种荧光染料。 带 Sasquatch 软件 (SQS) 的 Invitrogen Bigfoot 全光谱流式细胞分选仪 能够实时进行光谱解析数据分析。SQS 带有一个荧光染料选择的机载工具，可查看复杂度指数（随着每个新荧光染料的添加更新配色方案 [A] 的质量），以及所选实验方案和荧光染料的视觉显示图 (B)。荧光染料光谱特征之间的预测重叠越多，则复杂度值越高，使得复杂度增加最小的荧光染料就是理想的选择。在本示例中， 使用30 个荧光染料的光谱实验方案，其复杂度指数为 7.70。SQS 的光谱相似性矩阵允许对荧光染料组合进行从低相似性到高相似性投影 (C)，从而在视觉上轻松识别导致复杂度增加的荧光染料组合，便于选择染料与指标的最佳配对。

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除了用于鉴定特定目标抗原的流式抗体外，还需选择细胞活性染料以在分析中排除死亡/行将死亡的细胞（如需了解更多信息，请参阅 BioProbes Journal—查看死活指标：不要让死亡细胞误导您的实验结果）。仅使用散射光参数不足以对活细胞进行设门，因为抗体可以非特异性地与死细胞结合，从而导致假阳性结果，影响信号分辨率。用于 鉴别死细胞最常见的试剂是胺反应性染料 (即 LIVE/DEAD 可固定死细胞染料)、非透性核酸结合染料 (即碘化丙啶、DAPI) 和酶底物 (即钙黄绿素、AM)。

一旦确定了可用的试剂及其特性，就可以按以下指南将荧光染料和抗体进行配对[2] (图 3)。

图 3.将荧光染料亮度和抗原密度进行配对。在每一个这些数据图中，x 轴都显示抗原密度和荧光染料亮度的最佳配对。
 

最后，为防止光谱特征出现偏差，不建议在光谱流式实验中使用垃圾通道 (Dump Channel) 或垃圾设门 (Dump Gate)。垃圾通道是指特意排除对多种标志物 (通常具有谱系限制) 呈阳性的细胞的过程，包括细胞活性染料。传统流式实验中，这种方法是将多个标志物在一个通道中同时进行检测，从而克服荧光检测通道数量的限制。然而，光谱流式细胞术没有这一限制，使用多个几乎相同的荧光染料可能会导致光谱解析过程中出现问题。将这些标志物分开进行检测，可以更深入地探究细胞的异质性，而不是忽略它们的表现 [3]。

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通常首先利用散射光特性区分细胞与碎片和电子噪声，并用于大致区分基本的细胞亚群。当细胞通过激光器时，可把光散射到各个方向。仅用光散射光参数，可将异质性样品中的细胞大致分为几个基本亚群，例如裂解全血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。即使是遵循限制细胞聚集的最佳规范来制备单细胞悬液时，细胞可能会发生聚集，从而导致出现沉淀或团块。可以通过散射光信号 (即前向角散射光 (FSC) 面积与 FSC-高度) 的组合来区分这些细胞黏连体与单个细胞，单个细胞会集中在流式图的对角线区域，而黏连体则会落在对角线区域的外面。观察细胞的验证性 图像 也是对设门有帮助的。使用时间参数观察时间与散射光或荧光的流式图，有助于确定液流的稳定性、激光器问题或样品问题。死亡或即将死亡的细胞可以通过 活性染料来与活细胞区分，因为死亡 / 即将死亡的细胞可能会与抗体发生非特异性结合，从而影响活细胞的真实表达情况。对单个活细胞的设门对于生成高质量流式数据至关重要 (图 4)。

图4.分级设门示例。典型的顺序设门策略显示了主要淋巴细胞群 (A)、单个细胞 (B)、活细胞 (C)、CD3 与表面 CTLA-4 细胞群 (D)。

立即查看：流式配色工具

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在选择试剂和设计初始实验方案之前，应使用各种工具 通过电脑模拟 检查流式配色方案，以确认试剂的选择和组合是否合适。 选择了实验方案中的荧光染料后，可使用复杂度指数评估配色方案中所有荧光染料的光谱相似性。复杂度检测考虑了整个配色方案中每对荧光染料的相似性水平。复杂度水平越低，表示荧光的扩散度越低，从而提高数据的分辨率。复杂度随着配色方案的增大而增加，但仔细选择相似性低的荧光染料，可以降低复杂度指数。为进一步确证已选择的配色方案是否合适，可检查扩散矩阵及相似度指数。配色方案设计的过程是理论性的，在初步确定实验方案后，还需用样品细胞测证该抗体组合。验证配色方案需要一个过程，首先根据经验评估其可行性，并且可能需要进行多次预实验，以确保更好地鉴定出目的细胞群。

1. McCausland, Megan 等著。"强大功能带来巨大责任：高维光谱流式细胞术支持临床试验。"Bioanalysis 13.21 (2021): 1597–1616.
2. Mahnke, Yolanda D., and Mario Roederer."优化多色免疫表型分析实验."临床检测诊断学 27.3 (2007): 469–485.
3. Boesch, Maximilian, Antonio Cosma, and Sieghart Sopper."流式细胞术：垃圾还是非垃圾通道。"免疫学杂志(Baltimore, Md.: 1950) 201.7 (2018): 1813–1815.
4. Stewart, Judith C., Michelle L. Villasmil, and Mark W. Frampton."固定后特定白细胞表面标志物的荧光强度变化。"Cytometry Part A: the journal of the International Society for Analytical Cytology 71.6 (2007): 379–385.
5. Cossarizza, Andrea 等著。"流式细胞术和细胞分选技术在免疫研究中的应用指南。"European journal of immunology 15.12 (2021): 2708–3145.
6. Ferrer‐Font, Laura 等著。"使用全光谱流式细胞术对高维免疫表型分析进行配色方案优化。"Current Protocols 1.9 (2021): e222.
7. Novo, David, Gérald Grégori, and Bartek Rajwa."利用非平方补偿矩阵为多参数光谱流式细胞术制作光谱解析模型。" Cytometry Part A 83.5 (2013): 508–520.