Clik-iT® EdU 细胞增殖测定法

图 1.BrdU、Click-iT EdU 和 Click-iT Plus EdU 染色。使用 (A) 基于抗体的传统 BrdU 法、(B) Click-iT EdU 法和 (C) Click-iT Plus EdU 法，对表达 GFP 的 A375 黑色素瘤细胞成像用于细胞增殖。 细胞核用 Hoechst 染料染成蓝色；粉色表示增殖信号；绿色表示 GFP。

Click-iT 标记法采用与反应伴侣（包括 EdU）的生物正交反应化学方法，这些反应伴侣并不内源性存在于生物分子、细胞、组织或模型生物中。点击化学法可用来通过修饰在活跃分裂的细胞的 DNA 合成期间掺入的核苷类似物，研究细胞增殖。

Click-iT EdU 测定法和 Click-iT Plus EdU 测定法替代BrdU (5-溴-2'-脱氧尿苷) 染色法，以使用多功能、生物正交和特异性标记反应进行细胞增殖测定。Click-iT 技术的优势在于其化学—小而独特，同时背景标记低。叠氮化物-炔烃点击反应是一种"弹簧承载式"反应，这种反应迅速发生并且形成具有高产率和强共价键的单一产物。鉴于 Click-iT 测定法的反应条件温和，这些试剂盒可以评估细胞增殖，同时保留用于 更好DNA 染色的细胞形态、DNA 完整性、抗原结合位点和荧光信号，以检查细胞周期。

在传统的 BrdU 测定法中，BrdU 掺入正在增殖的细胞的新合成 DNA 中，这些细胞使用抗 BrdU 抗体鉴定。需要使用 Hcl、热或 DNA 酶消化进行 DNA 变性，以使掺入的 BrdU 暴露于抗 BrdU 抗体供检测。这个过程可能因苛刻条件而导致不需要的伪影并且延长检出时间。这类严厉的处理可能导致染色不一致和信号降低。不同于 BrdU， EdU 可以因荧光叠氮化物尺寸小而在 DNA 掺入后轻易检出，且不需要抗体或 DNA 变性供检测。因此，Click-iT EdU 细胞增殖测定法的使用保留蛋白质 3D 结构与功能，比传统 BrdU 染色法更好地减少标靶干扰。凭借其温和的反应条件，相比基于抗体的 BrdU 细胞增殖测定法，Click-iT EdU 细胞增殖试剂盒允许结果更一致、方案更快和信噪比更好。

点击检测法的简单性使 EdU 测定法更快地替代 BrdU 测定法。

5-溴-2'-脱氧尿苷 (BrdU) 是一种掺入新合成 DNA 中的合成性胸腺嘧啶类似物。可以使用基于抗体的  BrdU 染色方案  以流式细胞仪或使用 BrdU 标记与检测法 以显微镜鉴定经 BrdU 标记的正在增殖的细胞。BrdU 染色可以与细胞表面和/或细胞内标靶组合，以帮助了解细胞功能。BrdU 和 EdU 可用于 同一实验中。为了尽可能减少 BrdU 和 EdU 染色之间的交叉反应性，我们推荐抗 BrdU 克隆 MoBU-1。

图2.BrdU 染色与抗体检测。检测掺入新合成 DNA 中的 BrdU 需要变性。选择酸、热和核酸酶处理用于变性。这些试剂不仅因苛刻条件而引起不需要的伪影，而且延长检出时间。这类严厉的处理可能导致染色不一致和染色信号降低。所示方案用于处理大鼠组织切片。从 流式细胞术用 BrdU 试剂盒的优化试剂盒和 抗 BrdU 抗体中选择。

不同于使用 BrdU 染色的测定法，Click-iT EdU 测定法不基于抗体，因此并不需要 DNA 变性以检测掺入的核苷。此外，为了提高实用性，Click-iT Plus EdU 测定法可以配合 R-藻红蛋白 (R-PE) 和 R-PE 串联体、荧光蛋白 (GFP 和 mCherry)以及 还在  BrdU和 EdU 双重染色实验中配合 BrdU 复用。Click-iT EdU 技术不仅已发展成为 流式细胞术试剂盒 和 成像应用 (包括 HCS)试剂盒，还适用于  免疫组织化学技术 (IHC) 测定法中 EdU 比色检测。当您平行比较这些方法时，用于细胞增殖的 Click-iT EdU 测定法和 Invitrogen Click-iT Plus EdU 测定法的益处显而易见。

图 3.使用 Click-iT 和 Click-iT Plus 检测法进行 EdU 染色。无需 DNA 变性就检测到掺入新合成 DNA 中的 EdU。简单、易遵循、稳健的方案允许可重现的明亮染色。Click-iT EdU 分析试剂盒配合大多数标准荧光基团偶联物使用。Click-iT Plus EdU 分析试剂盒为多重分析灵活性最大化而设计，并且兼容于 R-PE (和串联体) 和荧光蛋白如 GFP 和 mCherry。所示方案用于处理大鼠组织切片。为用于 流式细胞术、成像、微量平板、高内涵筛选和 比色免疫组织化学应用而开发的优化试剂盒。

Click-iT EdU 细胞增殖试剂盒利用铜介导的叠氮化物-炔烃点击环加成过程检测 EdU。鉴于铜可能损坏蛋白质和核酸，故开发了 Click-iT Plus EdU 细胞增殖试剂盒，该试剂盒包含 Invitrogen Alexa Fluor 吡啶甲基叠氮化物，用于铜敏感化合物存在下检测 EdU。吡啶甲基叠氮化物与螯合铜高效反应，从而点击反应中游离铜最少化，防范不利地相互作用于蛋白质 (如绿色荧光蛋白 (GFP)、R-藻红蛋白 (R-PE)、核酸 (如 RNA、寡核苷酸) 和小分子药物。吡啶甲基叠氮化物提供比标准叠氮化物更高的灵敏度和更快的反应时间，并允许多重分析，同时保留标准叠氮化物 -炔烃点击反应的益处 (表 3)。Click-iT Plus 测定法可以确定细胞增殖,同时保留用于 更好 DNA 染色的细胞形态、DNA 完整性、抗原结合位点和荧光信号，以检查细胞周期。

传统上通过以下方式评估细胞增殖：将细胞与单“脉冲”的核苷类似物孵育，这种核苷类似物掺入正活跃分裂的细胞的 DNA 中，随后使用放射性、抗体或点击化学进行检测。许多应用受益于两种不同类似物在不同时间点掺入 (双脉冲标记)，这可以进一步区分细胞增殖及确定细胞周期动力学。通常用 BrdU 和另一种类似物进行细胞增殖的双脉冲标记，如 5-氯-2´-脱氧尿苷 (CldU) 或 5-碘代-2´-脱氧尿苷 (IDU)，这也需要抗原特异性高而无交叉反应性的抗体。

使用高特异性抗 BrdU 抗体时，BrdU 标记技术可以与点击化学检测法组合用于使用 EdU 的双脉冲标记简化方法。对于双脉冲应用，使用 EdU 作为核苷类似物之一大幅度简化该方法，原因是 Click-iT 叠氮化物检测试剂与掺入的 BrdU 之间无反应性。此外，几种抗 BrdU 抗体（包括 MOBU-1 克隆）不与 EdU 交叉反应。

备注：BrdU 相对于 EdU 优先掺入，因此在双脉冲标记中需要在 BrdU 之间给予 EdU。

图4.双脉冲 BrdU 和 EdU 染色示例。EdU (绿色) 和 BrdU (红色) 的免疫荧光。数据生成自：Gómez-Nicola D, Valle-Argos B, Pallas-Bazarra N, Nieto-Sampedro M. Interleukin-15 regulates proliferation and self-renewal of adult neural stem cells (白介素 -15 调节成人神经干细胞的增殖和自我更新).Mol Biol Cell.2011 Jun 15;22(12):1960-70.PMID: 21508317

图 5.使用 Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 流式细胞术分析试剂盒和 FxCycle Violet 染液进行细胞增殖分析。 根据 Invitrogen Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 流式细胞术分析试剂盒 (C10632) 的方案，将 Jurkat 细胞用 10 μ MEdU 处理 1 小时并用 Invitrogen Alexa Fluor 488 吡啶甲基叠氮化物染色，然后用 Invitrogen FxCycle Violet 染液 (F10347) 染色。随后使用 488 nm （对于 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 染料）或 405 nm （对于 FxCycle Violet 染液）激发，通过流式细胞术分析细胞。(A) 显示 S 期（DNA合成，包括 EdU 掺入）细胞和 G₂/M 或 G₀/G₁ 期细胞明显分离的直方图。(B)  显示使用 FxCycle Violet 染色剂时 DNA 含量分布的直方图，G₀/G₁ 期峰和 G₂/M 期峰依据 S 期分布分开。(C)  双参数 Click-iT Plus EdU 图和 FxCycle 图显示了直接计量 S 期细胞百分比的共阳性细胞。

•  应用备注：体内使用 Click-iT EdU 细胞增殖测定法
•  海报：用于流式细胞术的 Click-iT EdU增强的多重分析兼容性
•  海报：在成像方面比较 BrdU 测定法和 Click-iT EdU 测定法
•  海报：胸苷类似物 EdU 和 BrdU 对细胞活力和周期进展的影响
• 出版物：Mead TJ, Lefebvre V. Proliferation assays (BrdU and EdU) on skeletal tissue sections.Methods Mol Biol.2014;1130:233-243.PMID: 24482177
• BioProbes 文章Click-iT Labeling Kits Detect Biomolecules Across Multiple Applications (Click-iT®标记试剂盒跨多种应用检测的生物分子)
• Click-iT EdU 试剂盒常见问答

• Click-iT EdU 成像试剂盒
• Click-iT Plus EdU 成像试剂盒方案
• Click-iT® EdU HCS 测定法方案
• BrdU 标记和检测方案
• Click-iT EdU 标记体内细胞增殖方案

• BrdU 和 EdU 双重染色方案

• 用于流式细胞术的 Click-iT EdU 方案

•  Click-iT EdU 流式细胞术分析试剂盒

•  用于流式细胞术的 BrdU 染色方案 (Invitrogen eBioscience 试剂）

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