用于免疫沉淀（IP）的珠状琼脂糖培养基历来都有一些难以克服的挑战，导致人们对 IP 持有一些并非总是正确的普遍看法。利用磁珠的 IP 技术的发展帮助科学界克服了关于 IP 的特定误区，从而为需要帮助优化 IP 实验的科学家提供了支持。阅读以下更多关于免疫沉淀的技巧。

四个免疫沉淀技巧


免疫沉淀技巧 #1 ：使用磁珠减少背景

背景来自哪里？免疫沉淀实验中的背景是一种额外的非特异性信号，与您的抗原或目标蛋白重量不一致。背景主要由两个原因引起：1）未将上清液与颗粒/树脂或珠子清晰分离， 2）琼脂糖或琼脂糖树脂的孔隙当使用琼脂糖或琼脂糖树脂的混悬液法时，是没有明确沉淀物的。因此，研究人员可能会意外地去除过多的混悬液（和宝贵的样品），或者去除不足，导致样品中含有可能提升背景的不需要的蛋白质。多孔的琼脂糖/琼脂糖树脂会吸附液体，以及不需要的蛋白质。即使进行了多次洗涤，仍然很难去除干扰性蛋白质，导致背景较高。

如何减少免疫沉淀中的背景

Dynabeads磁珠可以磁化，与磁力架一起使用时，可轻松将其拉到样品管的一侧。这一特点使得移除缓冲液或上清液变得非常容易，不会造成任何破坏或样品损失。

Dynabeads磁珠的一个关键特点是其表面清晰，没有孔隙。所有的结合都发生在外表面，从而防止任何不需要的蛋白质被困在内部。

为了进一步减少免疫沉淀中的背景，建议彻底洗涤含有感兴趣蛋白质的磁珠，以去除任何不需要的蛋白质或蛋白质片段。

图 1.用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A 磁珠与其他供应商的对比。进行Western blot来比较使用 1）Sepharose离心柱，2）Sepharose混悬液，3）琼脂糖混悬液和离心柱，4）树脂离心柱，5）Dynabeads Protein A磁珠 的方案时间和背景的差异，每种方法一式两份。Dynabeads Protein A磁珠的免疫沉淀具有低背景且至少节省14分钟的时间。Dynabeads Protein G IP 试剂盒 也可提供。

视频：打破了背景不可避免的误解


免疫沉淀技巧 #2 ：无需预先清除用于 IP 的裂解物，即可避免背景

有一种IP误解认为，要获得高质量的结果，就必须在免疫沉淀过程中预先清除裂解物。然而，这个误解认为，非目标蛋白的其他蛋白质可能会与固相发生非特异性结合。为了解决这个问题，通常会进行预清除步骤，即将固相（不含抗体）加入样品中一段时间，然后移除，以去除不需要的非特异性蛋白质和背景。然而，进行IP的预清除步骤需要使用双倍量的固相，并增加了整个免疫沉淀方案所需的时间。

使用 Dynabeads 磁珠与特异性抗体偶联后，无需预清除，因为它并不识别非特异性蛋白质。该方法不仅节省了一半所用固相量，还缩短了方案时间。

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图 2.不进行预清除的Dynabeads Protein G磁珠与进行预清除的琼脂糖 Protein G微珠之间的背景水平比较。进行Western blot来比较两种方法的背景水平，1）进行预清除的Sepharose Protein G珠和2）不进行预清除的Dynabeads Protein G磁珠 ，每种方法的样品一式八份。结果显示，使用Dynabead Protein G磁珠进行免疫沉淀能始终沉淀出更多的相关蛋白。我们也提供 Dynabeads Protein A 磁珠。

视频：打破必须进行预清除的误解


免疫沉淀技巧 #3 ：平衡结合能力、产量和特异性

一些研究人员认为，更高的结合能力更适合免疫沉淀。该 IP 误解是基于琼脂糖和琼脂糖微珠的抗原结合能力。琼脂糖和琼脂糖微珠具有外表面和内表面，可与蛋白质结合的总面积大，因此结合能力高。这种高容量意味着这些微珠和树脂还可以非特异性地结合样品中存在的其他蛋白质。研究人员在选择 IP 技术时需在容量、产量、特异性和成本之间取得平衡。

可以使用磁珠，磁珠外表面与能识别相关蛋白质的抗体结合。由于使用柱式免疫沉淀方法以外的免疫沉淀只需要1-10 µg的抗体，因此并不需要高结合能力的试剂，而且成本效益不高。只需使用实验所需的确切量即可——这样可以节省实验室的抗体、试剂和免疫沉淀磁珠。

视频：打破高结合能力固相至关重要的误解


免疫沉淀技巧 #4 ：计算 IP 节省成本

研究人员可能会认为Dynabeads磁珠价格昂贵，而琼脂糖/琼脂糖混悬液则更具成本效益。然而，如果考虑到磁珠不需要预清除步骤，那么每个样品的价格是相当的，甚至可能更低。

在计算IP的成本时，研究人员可能会考虑固相的成本与固定体积固相的结合能力。然而，正如我们在技巧#3中了解到的，固相的高结合能力对于免疫沉淀实验并不关键，可能是多余的，导致使用更多昂贵的抗体。

计算IP成本的正确方法是查看进行一次免疫沉淀所需的磁珠和抗体的最低用量。由于琼脂糖/琼脂糖混悬液通常需要预清除，因此这些珠子的成本必须加倍。由于Dynabeads磁珠具有较少的非特异性结合且不需要预清除，因此在免疫沉淀实验中使用Dynabeads磁珠比使用琼脂糖/琼脂糖珠更具成本效益。观看以下视频查看准确的价格金额。

视频：打破高质量磁珠不具成本效益的误解

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免疫沉淀视频

视频：免疫沉淀方法对比

观看此视频对比两种 IP 方法：Dynabeads 磁珠和琼脂糖/琼脂糖混悬液。

视频：从琼脂糖/琼脂糖混悬液到免疫沉淀磁珠

观看本视频，了解科学界从使用琼脂糖/琼脂糖混悬液到使用 Dynabeads 磁珠进行免疫沉淀的转变，以及这两种方法的概述。

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文献

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