羰基反应交联剂化学特性

作为交联靶标的羰基（醛）

醛 (RCHO) 和酮 (RCOR') 是较常见官能团（称为羰基）的反应类型，其具有碳氧双键 (C=O)。通过该键的极性（特别是在醛背景下），碳原子具有亲电性并与一级胺等亲核试剂发生反应。

尽管醛在常规生物样本中的蛋白质或其他目标大分子中并非自然存在，但在任何可氧化的糖基团（也称为还原糖）存在之处都可以生成醛。此类糖是许多蛋白（即糖蛋白）的翻译后修饰（糖基化）中多糖或碳水化合物的常见单体成分。此外，RNA 的核糖是还原糖。

溶解的高碘酸钠 (NaIO₄) 中的高碘酸 (HIO₄) 是人们所熟知的温和氧化剂，可有效氧化碳水化合物糖中的邻二醇，产生具有反应性的醛基团。碳碳键在相邻羟基之间被切割。通过改变所用高碘酸钠的含量，可以在较小或较多的糖类上生成醛类。例如，使用 1 mM 高碘酸钠处理糖蛋白通常只影响唾液酸残基，而后者经常出现在多糖链末端。在浓度为 6 至 10 mM 高碘酸钠中，蛋白质中的其他糖基将受到影响。

由于多糖位于 Fc 区，远离抗原结合位点，因此碳水化合物修饰特别适用于在多克隆抗体上生成偶联的靶位点。这导致标记或交联位点位于远离抗原结合位点的位置，确保抗体功能不会因偶联过程而受到负面影响。

高碘酸钠与糖残基的反应会产生用于偶联反应的醛类。R 和 R' 代表多糖的连接糖单体。红色星号表示二醇的切割位点。唾液酸也称为 N-乙酰-D-神经氨酸。

由于多糖位于 Fc 区，因此碳水化合物修饰特别适用于在多克隆抗体上生成偶联的靶位点。这导致标记或交联位点位于远离抗原结合位点的位置，确保抗体功能不会因偶联过程而受到负面影响。

醛基反应性交联剂活性基团

综上所述，一级胺 (–NH₂) 的亲核种类是与醛类化合物反应的主要化合物类别。由于蛋白质中含有大量一级胺，请务必记住，醛基可以作为胺反应的交联化学基团，就像一级胺可以作为醛基反应的交联化学基团一样（本页面）。

然而，蛋白的天然一级胺（多肽的 N 端和赖氨酸的侧链），以 R–C–NH2 的形式存在，在无特定条件和未加入稳定键的化合物时，与醛的反应并不强烈或持久。这种反应称为还原胺化，因为其主要应用不涉及可以合成到现成标记或交联试剂中的离散反应基团，我们将在本文末尾讨论。

相反，酰肼和烷氧基胺是合成标记试剂和交联剂中最重要的醛反应功能基团。这些化合物中的末端氨基基团比蛋白胺更强亲核，并且它们与醛可自发反应形成稳定键。

酰肼反应化学特性

通过让生物样本中的糖发生过碘酸氧化而产生的醛类，在 pH 5 至 7 的环境中与酰肼反应，形成腙键。虽然与酰肼的键合属于席夫碱类型，但它的稳定性显著高于与简单胺基形成的席夫碱。在大多数蛋白标记应用中，腙键已足够稳定。然而，如果需要，可使用氰基硼氢化钠将双键还原为更稳定的仲胺键（请参阅本页末部分的还原胺化反应）。

用于与醛基化学偶联的酰肼反应方案。R 代表标记试剂或具有酰肼反应性基团的交联剂的一端； P 代表糖蛋白或含有目标官能团的或其他糖基化分子（例如，通过让唾液酸等碳水化合物 - 糖基团发生过碘酸氧化所形成的醛基）。

酰肼因具有低分子量 (<1,000 Da) 和明亮的荧光信号，用于穿过细胞间隙连接并跟踪神经投射的极性示踪剂。因此，酰肼常用于与标记的右旋糖酐（保留在细胞内）一起研究神经元通信。酰肼以各种荧光颜色存在，可以与其他探针多方式使用。以下共聚焦图像提供了用于神经元示踪的酰肼代表性示例。

神经元染色。小脑矢状切片中 10,000 MW 钙绿葡聚糖标记的攀缘纤维的共聚焦图像，显示传入轴突和末端树枝化（黄色）。受此纤维支配的浦肯野细胞由 Invitrogen Alexa Fluor 568 酰肼标记。

酰肼偶联的苯胺催化

近期发现，苯胺可作为酰肼 - 醛反应的催化剂。苯胺的芳香胺能与醛迅速且高效地形成席夫碱，有效增强了醛的活化。因此，酰肼可轻松取代苯胺。因此，苯胺（也称为 GlycoLink 偶联催化剂）能够显著提高与酰肼的总偶联产率和/或提高反应效率（即在使用较少酰肼试剂的情况下实现相同产率）。GlycoLink 偶联催化剂可缩短反应时间和提高醛-酰肼偶联效率，在 4 小时内实现超过 90% 的糖蛋白偶联。

有关苯胺催化的其他信息，请参见以下参考资料：

1. Byeon, J.Y., et al.(2010).Efficient bioconjugation of protein capture agents to biosensor surfaces using aniline-catalyzed hydrazone ligation.Langmuir 26(19):15430-5.
2. Dirksen, A., et al.(2006).Nucleophilic catalysis of hydrazone formation and transimination: implications for dynamic covalent chemistry.J. Am. Chem.Soc.128(49):15602-3.
3. Dirksen, A., Dawson, PE.(2008).Rapid oxime and hydrazone ligations with aromatic aldehydes for biomolecular labeling.Bioconjug.Chem.19(12):2543-8.

要了解有关苯胺的更多信息，请参见下表。

表 1.多克隆抗体（和卵清蛋白）的糖基化特性及其与 Thermo Scientific GlycoLink 树脂耦合的效率在每次实验中，0.4 mg 蛋白与 0.1 mL 树脂反应

酰肼交联的应用

1.使用双酰肼化合物

市售同型双功能酰肼化合物（即每端具有酰肼基团的化合物）包括碳酰肼 (MW 90.1) 和己二酸二酰肼 (ADH， MW 174.2)。此类双酰肼化合物可在单次反应中用于交联和聚合制备（含醛）的糖或多糖。然而，它们更常用于分两阶段对分子进行修饰和偶联，可以是同型双功能或异双功能方式。

例如，通过在大量的过碘酸氧化的右旋糖酐（多糖）中反应 ADH，每个 ADH 分子的一端将会与之偶联，从而导致葡聚糖的酰肼活化。脱盐后去除多余的未反应 ADH，可以添加少量含醛基的配体在多个位置与体积更大的右旋糖酐偶联。

由于每种酰肼也是一种胺基，因此双酰肼化合物可采用多种方法进行异双功能偶联。例如，ADH 可能与其核糖基团已氧化形成醛基的 RNA 寡核苷酸发生大量反应。脱盐以去除过量 ADH 后，EDC（碳二亚胺反应化学特定）可用于将含羧基的标记或载体分子偶联到胺基化的核酸上。

2.制备特异性糖蛋白偶联物

对端含有巯基反应性马来酰亚胺基团的异双功能酰肼交联剂，可用于将糖蛋白与其他蛋白或分子偶联。有关马来酰亚胺基团的信息，请参阅关于硫醇反应性化学交联剂的页面。此处之所以提及醇-巯基交联剂，因为马来酰亚胺是少数几种可以与酰肼在单一试剂中配对的基团之一。这是因为酰肼含有一级胺，不能与 NHS 酯等反应性胺基在同一分子中配对。

然而，这种有限的试剂选择并不意味着与碳水化合物偶联的应用仅限于具有天然巯基的蛋白。这仅仅表示，对于希望连接到碳水化合物大分子的任何人，都必须首先对其进行修饰，以包含巯基。类似于上文所述的双酰肼方案，需要存在可修饰分子以包含巯基的试剂。例如，Traut 试剂（2-亚氨基硫杂环戊烷，2-IT）和 SATA 将在一级胺上添加巯基。

在按顺序进行马来酰亚胺-酰肼交联时，通常先进行巯基的反应，然后再进行含有已制备醛基分子的反应。也可以采取相反的顺序，但必须迅速完成初始步骤，以防止马来酰亚胺基团的水解。

制备相应分子偶联靶标的最佳交联方法和修饰策略取决于多种因素。尽管可以调整条件以使用马来酰亚胺-酰肼交联剂，但许多类似的偶联目标可以采用不同的策略实现。例如，关于制备抗体-HRP 偶联物的还原胺化讨论，请参见本页末尾。

3.糖蛋白标记

酰肼活化的生物素化合物在生物素化糖蛋白和其他糖化分子或多糖的应用中具有许多用途。生物素是具有特异性的标签，通过该标签，生物素化分子可以使用链霉亲和素树脂或探针在板式测定或蛋白免疫印迹中进行亲和纯化或检测。

示例 1（对纯化糖蛋白进行生物素化） - 定制抗体 (IgG) 最常进行生物素化，用于通过使用 NHS 酯试剂的一级胺进行 ELISA 和其他免疫检测程序。但是，如果抗原结合位点含有已标记的一级胺，则该策略可导致抗体失活。替代方法是在糖基化位点对抗体进行生物素化，大多数抗体（特别是多克隆抗体）在远离抗原结合域的离散位置处具有糖基化位点。如果许多纯化酶和目标结合蛋白 (1) 在功能结构域以外的位点处进行糖基化和 (2) 未通过过碘酸盐处理失活，则可以使用本策略进行生物素化并维持功能性。

示例 2（细胞表面糖蛋白标记） – 多糖和糖蛋白的原位或复杂混合物可使用生物素标记，以便后续使用酰肼生物素试剂进行纯化或检测。当使用过高碘酸钠处理的样本与所研究的生物学不兼容时，采用了醛生成的酶法（例如：神经氨酸酶和半乳糖氧化酶）（参见 Bayer, EA, et al., 1988 Anal.Biochem.170:271-81）。

4.糖蛋白固定

如同抗体（或其他纯化的糖蛋白）可以通过碳水化合物基团进行生物素化，从而保留未受阻的功能性结合位点，它们也可以固定在亲和树脂和其他固体支持物（经活化含有酰肼基团）上。

例如，GlycoLink 偶联树脂是经酰肼活化的 Thermo Scientific UltraLink 树脂，这是一种用于蛋白质亲和纯化方法的耐用丙烯酰胺型多孔树脂。树脂和试剂盒程序针对使用过碘酸钠进行碳水化合物制备和苯胺催化的抗体固定进行了优化（参见上文关于苯胺分析的讨论）。使用该技术进行免疫沉淀也可使用小型固定试剂盒和方法。

通过 GlycoLink 树脂进行糖蛋白固定的化学特性带有氧化糖基的蛋白包含醛基，醛基能够与经酰肼活化的磁珠树脂支持物发生偶联

原则上，对于几乎任何可以经修饰以含有酰肼基团的硬质或多孔表面材料，其均可以用于固定含可氧化碳水化合物或其他含醛基部分的分子。

烷氧基胺反应化学特性

尽管烷氧基胺化合物目前不如酰肼试剂一样常用或常见，但其与羰基（醛和酮）偶联的方式与酰肼大致相同。在这种情况下，反应会产生肟键。与酰肼的相似性还包括使用苯胺作为催化剂。烷氧基胺也通常被称为"胺氧基"或"胺氧基"基团。

用于与醛化学偶联的烷氧基胺反应方案。R 代表标记试剂或具有烷氧基胺（胺氧基）反应性基团的交联剂的一端；P 代表糖蛋白或含有目标官能团的或其他糖基化分子（例如，通过让唾液酸等碳水化合物 - 糖基团发生过碘酸氧化所形成的醛基）。

烷氧基胺交联的应用

目前可用的烷氧基胺试剂较少。原则上，任何上述基于酰肼的应用均可通过烷氧基胺类似物完成。

还原胺化反应化学特性

如本文引言所述，涉及生物样品时，醛偶联也必然是胺基偶联。换言之，本节既适用于讨论胺反应性交联化学特性的文章，也适用于当前关于羰基化学特性的页面。

在还原胺化的过程中，醛的亲电碳原子会攻击一级胺的亲核氮，从而产生弱键（称为席夫碱）。与上文探讨的使用酰肼或烷氧基胺所形成的键不同，与普通胺基所形成的席夫碱在水溶液中迅速水解（逆反应），必须还原为烷基胺（仲胺）键才能稳定。氰基硼氢化钠 (NaCNBH₃) 是一种温和的还原剂，可有效执行该功能，同时不会还原生物样品中的其他化学基团。

与碳二亚胺交联化学特性（羧基-胺）一样，还原胺化（醛-胺）属于是零长度交联方法（在偶联物中不引入间隔臂）。

还原胺化，即醛和一级胺发生偶联。初始反应会产生较弱的可逆席夫碱键。使用氰基硼氢化钠还原后，可形成稳定且不可逆的仲胺键。

还原胺化交联的应用

1.甲醛和戊二醛交联

这两种反应性醛化合物通过聚合、席夫碱形成（胺化）和曼希反应（活性氢原子）的组合，在胺和其他基团中迅速且不加选择地交联。它们作为组织和细胞孵育样品的防腐剂和固定剂，这些特性为显微镜检查和染色、免疫组织化学 (IHC) 和高内涵筛选的广泛应用提供了基础。

如果过量添加戊二醛（双醛），可用于通过还原胺化将一种纯化蛋白的胺活化，以便与另一蛋白偶联。这与上述使用 ADH（双酰肼）与葡聚糖的酰肼活化策略相反。

2.蛋白与糖蛋白偶联

辣根过氧化物酶 (HRP) 的醛基活化及其与抗体 (IgG) 发生的偶联作用，可用于阐明蛋白质交联的还原胺化应用之一。HRP 是一种糖蛋白，可通过过碘酸盐氧化产生反应性醛，而不会对其功能活性产生不利影响。当制备好的 HRP (40 kDa) 与 IgG (150 kDa) 按适当的比例（通常过量 3 至 5 倍）结合时，两种蛋白将通过还原胺化进行偶联。添加氰基硼氢化钠以稳定键。

HRP 是一种常用的报告基因酶，因此它以预先活化（经过高碘酸钠处理）形式市售，可直接与纯化抗体偶联。

如上所述，使用高碘酸钠活化的 HRP 比使用戊二醛的传统方法更有效。大多数抗体也是糖蛋白；因此，本例可以逆转整个策略。因此，根据需要偶联的蛋白的独特特性，某种其他偶联方法或方向可能更有效。实验测试通常是最佳战略的唯一途径。

蛋白质官能团靶标位于代表性蛋白上。该图描述了免疫球蛋白 (IgG) 的一般结构。重链和轻链通过非共价相互作用与共价链间二硫键的组合保持在一起，形成双边对称结构。H 和 L 链的 V 区域包含免疫球蛋白 (Ig) 分子的抗原结合位点。每个 Ig 单体含有两个抗原结合位点（称为双价）。铰链区是第一个和第二个 C 区域结构域之间 H 链的区域，通过二硫键固定在一起。这种灵活的铰链（在 IgG、IgA 和 IgD 中存在，但不包括 IgM 或 IgE）区域允许两个抗原结合位点之间的距离变化。还展示了几种可用于实际生物偶联的可选择功能基团。

3.通过一级胺固定蛋白

在制造业以及研究中，将抗体或其他蛋白质通过普通还原胺化共价结合到磁珠琼脂糖树脂上，以进行亲和纯化程序是最可靠和最受欢迎的方法之一。AminoLink 树脂和 AminoLink Plus 树脂是精心制备的醛活化琼脂糖树脂种类。如胺反应性交联剂化学文章中所述，几乎所有蛋白在其表面均有多个一级胺，可提供多个供偶联的靶位点（在本例中为固定）。

在适当的无胺和碱性缓冲液中，添加（或随后添加）氰基硼氢化钠后，蛋白通过永久仲胺键与琼脂糖树脂偶联。可实现高密度的稳定固定化蛋白，从而能够进行多次亲和纯化（结合、洗涤和洗脱），而不会发生降解或渗漏。AminoLink Plus 树脂也是用于免疫沉淀的 Direct IP 试剂盒的基础要素。以下图标对此过程进行了概述。

抗体固定。本图描述了 Thermo Scientific AminoLink Plus 偶联树脂的化学反应。树脂是一种醛活化的磁珠琼脂糖，可通过一级胺共价连接抗体、其他蛋白和分子。结果是获得一种可重复使用的亲和树脂，适用于各种纯化方法。

标准 AminoLink 树脂程序使用接近中性的偶联缓冲液（PBS，pH 7.2），其中包含反应全程所需的氰基硼氢化钠（AminoLink 还原剂）。AminoLink Plus 树脂的可选高产率程序需要将蛋白质与树脂置于碱性更高的偶联缓冲液（柠檬酸-碳酸盐，pH 10）中进行初步孵育。在该碱性条件下，席夫碱形成更为有效，但之后必须将缓冲液更换为接近中性的 PBS，并添加氰基硼氢化钠进行还原步骤。不适合高 pH 偶联条件的蛋白可以使用接近中性条件固定。可以加入各种添加剂和成分，从而让蛋白在反应中溶解或保持溶解状态。

1. Byeon, J.Y., et al.(2010).Efficient bioconjugation of protein capture agents to biosensor surfaces using aniline-catalyzed hydrazone ligation.Langmuir 26(19):15430-5.
2. Dirksen, A., et al.(2006).Nucleophilic catalysis of hydrazone formation and transimination: implications for dynamic covalent chemistry.J. Am. Chem.Soc.128(49):15602-3.
3. Dirksen, A., Dawson, PE.(2008).Rapid oxime and hydrazone ligations with aromatic aldehydes for biomolecular labeling.Bioconjug.Chem.19(12):2543-8.Bayer, EA, et al., 1988 Anal.Biochem.170:271-81