巯基反应性交联剂化学

除了胺反应性化合物，含与巯基 (–SH) 形成键的化学基团的化合物是蛋白质和其他生物偶联技术最常见的交联剂和修饰试剂。巯基，也称为硫醇，在蛋白质中存在于半胱氨酸 (Cys, C) 氨基酸的侧链中。半胱氨酸巯基基团对通常通过多肽链内或多肽链之间的二硫键 (– S – S –) 连接，作为天然三级或四级蛋白结构的基础。通常，只有游离或还原型巯基基团 (-SH) [ 而非二硫键中的硫原子 ] 可用于与硫醇反应性化合物反应。

巯基基团是蛋白偶联和标记的有用靶标。首先，巯基存在于大多数蛋白中，但不像伯胺那样多；因此，通过巯基基团的交联更具有选择性和精确度。第二，蛋白中的巯基通常与二硫键有关，因此在这些位点的交联通常不会显著修饰潜在蛋白结构或封闭结合位点。第三，可用 (即游离) 巯基基团的数量可轻松控制或修饰；它们可通过还原天然二硫键生成，或者可使用巯基加成试剂通过与伯胺反应引入分子，如 2-亚氨基硫烷 (Traut 试剂)、SATA、SATP 或 SAT (PEG)₄。最后，将巯基反应性基团与胺反应性基团结合，形成异型双功能交联剂在交联程序中提供更高的灵活性和控制。

巯基反应性化学基团包括卤乙酰基、马来酰亚胺、氮杂环丁酰、巯基、芳基化剂、乙烯基硫酸酯、吡啶二硫化物、TNB 硫醇和二硫化物还原剂。这些基团大多数通过烷基化 (通常形成硫醚键) 或二硫键交换 (形成二硫键) 与巯基偶联。

马来酰亚胺酯反应化学

当反应混合物的 pH 值在 6.5 至 7.5 之间时，马来酰亚胺基团与巯基发生特异性反应；其结果是形成不可逆的稳定硫醚键 (即，该键不能用还原剂裂解)。在更多碱性条件 (pH 值 >8.5) 下，反应有利于伯胺，还可提高马来酰亚胺基团水解成非反应性 马来酰胺 酸的速率。马来酰亚胺不会与 酪氨酸、 组氨酸 或 蛋氨酸发生反应。

含硫醇的化合物(如 二硫苏糖醇  (DTT) 和 β-巯基乙醇  (BME)) 必须从使用 马来酰亚胺 的反应缓冲液中排除，因为它们将竞争偶联位点。例如，如果使用 DTT 还原蛋白中的二硫化物以使巯基团可用于偶联，在开始马来酰亚胺反应之前，必须使用脱盐柱彻底去除 DTT。有趣的是，二硫键还原剂 TCEP 不含硫醇，在涉及马来酰亚胺试剂的反应之前无需去除。

通过添加游离硫醇，在反应结束时淬灭过量 双马来酰亚胺 。EDTA 可包含在偶联缓冲液中，以螯合杂散二价金属，从而促进巯基氧化 (非反应性)。

与巯基化学偶联用马来酰亚胺反应方案。 R 代表标记试剂或具有马来酰亚胺反应性基团的交联剂的一端；P 代表含有靶标官能团 (即巯基，-SH) 的蛋白或其他分子。

1.在半胱氨酸之间建立不可还原性键合

同型双功能马来酰亚胺交联剂 (即每端都有马来酰亚胺基团的交联剂) 可在半胱氨酸之间为永久非还原性键合的蛋白结构中来替代胱氨酸二硫键。首先，必须使用 TCEP 或其他还原剂裂解天然二硫键。然后添加马来酰亚胺交联剂将通过硫醚键来成对偶联半胱氨酸巯基。虽然任何两个巯基基团都可以偶联，但人们预期大多数交联半胱氨酸之间形成，从而在天然二级和三级结构中自然缔合。

同型双功能马来酰亚胺交联剂的巯基-巯基交联在某些特定情况下可用特殊的蛋白或巯基分子对。但是，这种方法并不经常使用。

2.准备特异性蛋白质偶联物

异型双功能马来酰亚胺交联剂 (即一端有马来酰亚胺基团，另一端有胺反应性基团) 通常用于以受控的方式将任何两种不同的纯化蛋白偶联 (而不会使蛋白质各自聚合或自偶联)。最常用的这些试剂是 NHS-酯/马来酰亚胺化合物，如Sulfo-SMCC 及其聚乙二醇化类似物 SM (PEG)_n。

Chemical structure of Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC). 它是一种不可裂解的非膜通透性交联剂。因为它包含亲水磺酰基团，磺基-SMCC 在水和许多常用缓冲液中溶解可达到近 mM，因此避免了使用可能会破坏蛋白结构的有机溶剂。

例如，使用 Sulfo-SMCC，辣根过氧化物酶 (HRP) 等报告基因酶可通过一个连续的两步程序与抗体或其他蛋白偶联，以生成一种可检测的亲和探针，用于以下检测：

• 首先，HRP 单独与交联剂反应，使 Sulfo-SMCC 的 NHS 酯末端能够在蛋白质表面的几种可用伯胺 (赖氨酸侧链) 上连接。这样会产生所谓的马来酰亚胺活化 HRP ，即用几个巯基反应性马来酰亚胺基团标记的 HRP 分子。
• 同时，抗体被单独处理，会在其表面产生可用的巯基基团。它可以用 2- 巯基乙胺 (2-MEA) 温和还原，以切割铰链区二硫化物，或者用 Traut 试剂 (2- 亚 氨基硫烷，2-IT) 或 SATA 修饰，以将巯基添加到伯胺位点。
• 第二，将两种活化蛋白混合在一起，允许 HRP 和抗体分子之间进行特异性的单向键合。在典型反应条件下，一至三种 HRP 分子与每个抗体分子偶联，基本不产生 HRP-HRP 或抗体-抗体偶联物。

对于多对蛋白，您可能希望通过这种方式进行偶联，可以在任一方向 (抗体上形成HRP 与巯基，或 HRP 上形成抗体与巯基) 进行交联，尽管 NHS 酯末端必须始终首先反应。HRP 等常用标记已市售，已制备成马来酰亚胺活化形式。然而，该策略可用于偶联几乎任何两种纯化蛋白，满足专业定制程序和实验之所需。

3.使用半胱氨酸终止的肽抗原制备免疫原

一个特殊但非常重要的例子是 NHS-酯/马来酰亚胺与 Sulfo-SMCC 和类似试剂的异型双功能交联，是将合成的含半胱氨酸肽抗原与免疫原性载体蛋白偶联，用于抗体生产。大载体蛋白，如 BSA 和 KLH，可使用 Sulfo-SMCC 进行马来酰亚胺活化，每种蛋白分子可含有数十至数百个马来酰亚胺基团。这样使得许多肽抗原能够与每个载体蛋白分子偶联。常用的载体蛋白以马来酰亚胺活化形式市售，但几乎任何特殊 "" 的蛋白和 SMCC 样交联剂的间隔长度变体可用于制备肽或其他小巯基分子的载体，用于专业研究应用。

4.制备特异性蛋白质-糖蛋白偶联物

异型双功能马来酰亚胺交联剂其相反端含有双功能反应性酰肼基团，可用于将蛋白与糖蛋白或其他多糖的碳水化合物偶联。有关酰肼基团的信息，请参见 羰基反应性交联剂化学 页面。此处提及巯基-碳水化合物偶联应用，因为马来酰亚胺是在单种试剂中可对酰肼相对配对的少数基团之一。这是因为酰肼基团含有伯胺，后者是 NHS 酯的靶标。下图显示了高碘酸盐氧化为醛与酰肼反应的化学过程。尽管如此，这并不意味着与碳水化合物的偶联只限于具有天然巯基的蛋白质。这仅仅意味着，无论人们希望将什么大分子连接到碳水化合物上，都必须首先对其进行修饰，以包含巯基。如上所述， Traut 试剂 (2-亚氨基硫烷，2-IT) 和 SATA 是将巯基添加到伯胺位点上的修饰试剂。

高碘酸钠化学。与糖残留物反应会产生醛类，供偶联反应之用。R 和 R' 代表连接多糖的糖单体。红色星号表示二醇裂解的位点。唾液酸也称为 N-乙酰-D-神经氨酸。 

5.使用生物素或荧光基团精确标记抗体或其他蛋白质

大多数用于标记大分子上巯基基团的生物素试剂和荧光试剂均基于马来酰亚胺化学反应。通常，使用 NHS 酯试剂对伯胺进行蛋白标记，但当在伯胺处标记时，某些蛋白可以因预期应用被灭活。相反，含巯基半胱氨酸的丰度通常低于含胺赖氨酸，并且可以提供更具特异性、均匀的标记。例如，抗体 (例如 IgG) 在铰链区含有二硫键，可以被选择性地还原以暴露那些巯基，以便用马来酰亚胺化合物进行标记。结果是一价 "半"抗体，每种抗体都使用一个生物素或荧光基团标记进行确切标记。下图显示了如何使用马来酰亚胺-PEG 固相生物素化试剂盒高效生物素化抗体。 

参与柱上巯基靶向抗体生物素化的步骤。  使用图中所示的方法，Thermo Scientific EZ-Link 马来酰亚胺-PEG 固相生物素化试剂盒有助于巯基靶向抗体生物素化，以更好地控制标记反应和纯化过程。 这种创新性抗体标记系统利用镍螯合琼脂糖通过抗体分子富含组氨酸的 Fc 区暂时固定化这些抗体分子。一旦在树脂上固定在适当位置，抗体可在铰链区温和还原，产生游离巯基，然后用马来酰亚胺-PEG2-生物素试剂对游离巯基进行生物素化。然后，使用温和的咪唑溶液，先洗去过量的标记试剂和副产物，再从树脂中回收标记和纯化的抗体。无需凝胶过滤或透析。 

卤乙酰反应化学

最常用的卤乙酰交联剂都含有碘乙酰或溴乙酰基团。卤乙酰在生理 pH 值环境下与巯基基团发生反应。碘乙酰基团继续反应，由巯基基团中的硫原子亲核取代碘，产生稳定的硫醚键合。在 pH 值 8.3 下使用比巯基基团略微过量的碘乙酰基团，可确保巯基选择性。在不含游离巯基的情况下，或者如果使用过大幅过剩的碘乙酰基团，碘乙酰基团可以与其他氨基酸发生反应。咪唑类可在 pH 值 6.9 至 7.0 的条件下与碘乙酰基团反应，但孵育必须持续一周以上。

组胺基侧链和氨基基团以未质子化形式与碘乙酰基团分别在高于 pH 5 和 pH 7 的条件下发生反应。为了限制游离碘的生成，它可能与酪氨酸、组氨酸和色氨酸残基发生反应，请在黑暗环境中进行碘乙酰反应和制备。避免碘乙酰化合物暴露于还原剂中。反应完成后，不再需要避光保护活化分子。 

Iodoa与巯基化学偶联的碘乙酰反应。R 代表标记试剂或一端具有碘乙酰基或溴乙酰基反应性基团的交联剂；P 代表含有靶标官能基团（即巯基，-SH)的蛋白质或其他分子。

1.卤代乙酰交联

原则上，同型双功能和异型双功能碘乙酰或溴乙酰交联剂的大多数应用与其马来酰亚胺同类产品相同然而，在实践中，生物偶联技术中市售或常用的卤乙酰交联化合物更少。与马来酰亚胺的一个区别是，卤乙酰基不含环结构；因此，它们可能产生非常短的交联。

2.碘乙酰标记试剂

多种碘乙酰生物素化试剂仍有市售，并且经常用于标记抗体和多种蛋白。熟悉荧光标记的人都会认识荧光素试剂 5-IAF (5-碘乙酰胺基-荧光素)。

尽管马来酰亚胺试剂更加常用，但仅经验检测和比较就可以确认：将更一致标记任何特定蛋白并且能够为之生成更好功能探针的是碘乙酰胺还是马来酰亚胺试剂。

3.碘乙酰固定化载体

有种应用是将蛋白质固定在微珠状琼脂糖树脂上，其中卤乙酰基仍然是更受欢迎的巯基反应性化学物质碘乙酰活化琼脂糖是 SulfoLink 偶联树脂和试剂盒的基础。该树脂可用于固定化半抗体 (参见上文) 或蛋白质亚基，它们的半胱氨酸二硫键已还原。然而，就碘乙酰活化琼脂糖而言，最重要最常见的应用是在使用含半胱氨酸的肽进行固定化和抗体生产后将这种肽固定化进行抗体纯化 (参见上文关于使用 Sulfo-SMCC 进行免疫原制备的讨论)。以下代表性蛋白凝胶说明了微量肽偶联试剂盒所取得的结果。  

使用微量肽偶联试剂盒从粗血清中高效纯化的抗肽抗体。 试剂盒离心柱中偶联的胰岛素肽 (245 µg) 用于从 40 µg 牛胰岛素抗血清中纯化抗胰岛素。使用 SDS-PAGE (4-20% 凝胶) 分离洗脱蛋白，并使用 Thermo Scientific GelCode Blue 染色剂 (产品编号 24590) 进行染色。

泳道1：40 µg 牛胰岛素抗血清 (粗血清)。
泳道2-7：交替非还原和还原组分 (A = 全 IgG；B = 重链；C = 轻链)。
泳道2 & 3：洗脱组分 1 (各 10 μL)。
泳道4 & 5：洗脱组分 2 (各 10 μL)。
泳道6 & 7：洗脱组分 3 (各 10 μL)。
泳道8：分子量标记 (产品编号 26681)。

吡啶二硫化物反应化学

吡啶二硫化物在较宽的 pH 值范围内与巯基反应 (最佳 pH 值为 4 至 5) 形成二硫键。在反应期间，分子的 -SH 基团与试剂的 2-吡啶二硫醇基之间发生二硫化物交换。因此，吡啶-2-硫酮产生，接着对其进行分光光度法测量 (A_max = 343 nm) ，以监测反应的进展。这些试剂可用作交联剂，并也可用于将巯基引入蛋白。二硫化物交换可在生理 pH 条件下进行，但在酸性条件下反应速率较慢。

与巯基可裂解 (可逆) 化学偶联的吡啶二硫醇基反应方案。 R 代表标记试剂或一端具有吡啶二硫化物反应性基团的交联剂；P 代表具有靶标官能团 (即巯基，-SH) 的蛋白或其他分子。

由于吡啶二硫醇基化合物与靶标巯基形成二硫键，使用这些交联剂制备的偶联物可被常见的二硫化物还原剂裂解，如二硫苏糖醇 (DTT) 或用于蛋白电泳 (SDS-PAGE) 的样品缓冲液。 因此，当在实验程序稍后需要逆转巯基偶联步骤 (即，精确回收含巯基的原始分子) 时，吡啶二硫化物交联剂和标记试剂是马来酰亚胺和卤乙酰试剂的有用替代品。

例如，在实验情况下，其中蛋白质偶联物成为将要进行电泳的样品的一部分，最好先将偶联物裂解并分离成原始组分。在某些实验中，比较使用可裂解交联剂和不可裂解交联剂的电泳或蛋白质印迹结果可能具有指导意义

作为第二个示例，人们可以使用 HPDP-生物素标记纯化蛋白，然后让这种蛋白在细胞裂解物样品中结合推定耦合子。下一步，完整的蛋白复合物可由生物素基团捕获到链霉素亲和素琼脂糖，刺客，二硫键可以裂解以释放蛋白相互作用复合物的所有组分，用于后续分析。

HPDP-生物素的化学结构。HPDP-生物素是一种吡啶二硫醇基-生物素化合物，用于标记蛋白半胱氨酸和含有巯基基团的其他分子。该试剂可在近中性缓冲液中与还原硫醇 (-SH) 进行特异性反应，形成可逆的二硫键。HPDP-生物素用于需要回收原始、未修饰分子的标记和亲和纯化应用。

最后，使用 Sulfo-LC-SPDP 以吡啶二硫醇基活化 DADPA 树脂可以创建可逆的巯基固定化树脂。

1. Ishikawa, E., et al.(1983).抗体的酶标记。J Immunoassay 4:209-327.
2. Brinkley, M.A. (1992).一项利用染料、半抗原和交联试剂制备蛋白偶联物的方法研究。Bioconjugate Chem 3:2-13.
3. Hashida, S., et al.(1984).通过铰链中的硫醇基团将 Fab 偶联至辣根过氧化物酶更有用的马来酰亚胺化合物。J Appl Biochem 6:56-63.
4. Mattson, G., et al.(1993).一种交联的实用办法。Molecular Biology Reports 17:167-83.
5. Partis, M.D., et al.(1983).通过 ω-马来酰亚胺基烷酰基 N-羟基琥珀酰亚胺酯进行蛋白交联。J Protein Chem 2:263-77.
6. Yoshitake, S., et al.(1982).使用马来酰亚胺化合物及其酶免疫检测应用对兔 Fab 和辣根过氧化物酶进行温和高效的偶联。J Biochem 92:1413-24