荧光相关光谱（FCS）——注释 1.3

荧光相关光谱（FCS）是一种在由紧密聚焦的激光束定义的约 10^-15 L（1 飞升）的微观检测体积中测量自发荧光强度波动的技术。 近年来， FCS 对新的兴趣不断得到激发，这一事实本身已经小型化，因此可用于高通量筛选应用。 通过 FCS 测量的荧光强度波动表示检测体积内分子数量或荧光量子产率的变化（图 1）。快速扩散的小分子会产生快速波动的强度模式，而大分子会产生更持久的荧光脉冲。

这种情况与常规荧光光度法形成鲜明对比，常规荧光光度法在约 0.1-1.0 mL 的样品体积（比 FCS 测量体积约大 10⁸ 倍）内进行，只能报告扩散相关强度波动的宏观平均值。在典型的荧光共振能量转移（FCS）测量中，检测体积内（例如 3 个分子/飞升，相当于约 5 nM 宏观浓度）的少量分子在约 1 微秒至1 秒的时间范围内的荧光强度被记录下来。然后根据时间自相关函数（G（τ））分析随时间变化的荧光强度（F（t））（该函数将时间t处的荧光强度与（t+τ）处的强度进行比较，其中 τ 是一个可变区间）在时间序列的所有数据点上进行平均：

自相关函数包含有关样品中分子的平衡浓度、反应动力学和扩散速率的信息。自相关函数的初始振幅与检测体积中的分子数量成反比。自相关函数从初始值衰减的时间取决于分子扩散率。例如，游离荧光配体的自相关衰减比移动较慢的复合配体快（图 2）。

图 1.荧光相关光谱数据的物理来源。游离荧光配体在检测体积（开放圆圈）内移动，并被检测为一系列随机短时荧光脉冲（左图）。大分子结合的配体移动性较差，产生波动较慢（即自相关性更高）的时间依赖荧光模式（右图）。

图 2.模拟的 FCS 自相关函数，分别代表低分子量配体（左曲线，蓝色）、大分子结合配体（右曲线，红色）以及自由和结合配体的 1:1 混合物（中间曲线，绿色）。

FCS 适用于监测多种生物分子的结合和分离过程（表 1）。由于 FCS 对这些过程中发生的质量变化具有内在的敏感性，因此探针的设计和选择通常不像基于染料-染料相互作用（FRET、自淬灭等）或环境依赖性荧光增强产生的宏观荧光强度变化的检测方法那样重要。在共聚焦激光扫描显微镜中表现良好的染料通常是 FCS 应用的最佳选择。用于激发 FCS 的激光源包括 488 nm 氩离子光谱线和 543 nm 及 633 nm 氦氖激光光谱线。通过跨系统交叉形成三重态比例可观的染料通常不适合用于 FCS 测量，因为这一过程会产生额外的亚毫秒自相关衰减分量。

双光子激发（TPE）被应用于 FCS，原因与它在荧光显微镜中的使用类似—激发固有的空间限制、减少光漂白和光毒性、减少散射以及提高在浑浊介质中的光学穿透性。 双色交叉相关荧光共聚物 FCS 测量两种光谱不同的染料随时间变化的荧光强度的交叉相关性，而不是对单一染料的常规自相关性。这种方法的优势在于，交叉相关荧光仅由两种染料标记的分子或复合物产生，从而无需参考其扩散特性即可对相互作用分子进行定量。在实践中，基于质量的传统荧光相关光谱法要求相互作用组分的分子量比至少为 1:7。有报道称，荧光相关光谱法测量结合了TPE和双色交叉相关法。

表 1.荧光相关光谱的应用