前线的表型分析

（参见作为本文特色的产品列表。）

大约十年前经鉴定，组织驻留记忆 T 细胞 (TRM) 提供免受外周组织中病原体和病毒影响的抗原特异性保护。以其组织驻留性和明显不能再循环性为特征，TR已经在肺组织、皮肤组织、肝组织、脑组织、肠组织和黏膜组织中被鉴定 [1-4]。虽然初始研究关注其在既往感染部位的持久性及其在抵抗再感染 (通过即时效应子功能和加速招募循环型免疫细胞) 中的长期作用，但还已经报道，TRM 积聚于肿瘤微环境中，包括上皮源 (卵巢、胰腺、结直肠和肺) 和非上皮源 (恶性神经胶质瘤和黑色素瘤) 的微环境 [5]。

癌症治疗中免疫检查点抑制剂 (抗 PD-1、抗 PD-L1 和其他等) 的疗效已导致研究人员推断，TRM是肿瘤微环境中能够启动并维持抗肿瘤反应的关键要素，原因是它们的抑制性受体高水平表达。可能的作用机制包括快速和局部的抗原特异性增殖反应，同时表达促进炎症和免疫细胞召集与分化的效应分子(IFNγ、TNFα、IL-2、IL-17) 以及指导靶细胞裂解的的效应分子 (穿孔素、颗粒酶 B) [6,7]。因此，认为增长的 TRM 活化是一种增强现有免疫治疗方法和疫苗接种功效的有成效策略。在本文，我们将回顾常用的 TRM 标志物并解决 TRM 流式细胞术检验组合开发问题。Thermo Fisher Scientific 为流式细胞术提供种类繁多的 Invitrogen 一抗和抗体偶联物，它们识别 TRM 的阳性标志物和阴性标志物 (参见下表 1)。

TRM 的关键细胞表面标志物

外周血 T 细胞群包含多种亚群，这些亚群可以依据 CD45RA、CCR7 (CD197) 和 CD62L (L-选择素) 的表达鉴别。这些亚群包括初始 (CD45RA+ CCR7+ CD62L +)、中央记忆 (TCM；CD45RA– CCR7+ CD62L +) 和效应记忆 (TEM；CD45RA– CCR7– CD62L–) T 细胞以及重新表达 CD45RA 的终末分化性效应记忆细胞(TEmra；CD45RA+ CCR7– CD62L–) [8]。TEM 在免疫监测中发挥重要作用并且是外周组织中 CD4+ T细胞群和 CD8+ T细胞群的主要亚群 [7,9]。相反，TCM 就同族抗原审视次级淋巴器官，而初始细胞一般局限于血液、脾脏和淋巴结 [8]。

CD69：人 TRM 通常与表面标志物 CD69、CD49a (整合素 α1) 和 CD103 (整合素 αE)的表达相关；这些标志物连同 CD44 一起用于研究小鼠 TRM。虽然 CD69 是 T 细胞早期活化的标志物,但大多数 TRM 在稳态条件下表达 CD69,而不表达其他的活化标志物，如 CD25、CD38 和 HLA-DR [10]。因此，CD69 是一种在大多数组织中 T RM 上组成型表达的重要区分性细胞表面标志物，并且它充当 S1PR1 (CD363) 活性的关键拮抗物 [11]。CD69+ TRM 群体在表型和转录上区别于组织和血液中的再循环型 CD69 - 记忆性 T 细胞，后者各自都具有确定的基因表达特征，这种特征包括与粘附、迁移和调节相关的分子 [6,7]。

CD49a：CD49a (整合素 α1) 也是一种在 TRM 中表达的重要标志物，因为它与 CD29 (整合素 β1) 一起作用以形成异源二聚体分子 VLA-1，后者可以结合胶原蛋白和层粘连蛋白并促进组织驻留性 [5,12]。

CD103：TRM 中 CD103 (整合素 αE)表达可变 [7]。CD103 在暴露于 TGF-β 后上调，并且它与 T 细胞表面上的整合素 β7 复合，以通过结合至上皮细胞上的 CD324 (E-钙黏蛋白) 引起黏附 [11]。CD103 表达限于黏膜部位和皮肤中的 CD8+ TRM i [7,8,9]。在上皮组织外部存在的 TRM 通常缺乏 CD103 表达，尽管它们可以表达其他黏附分子，如 LFA-1，其是一种由 CD11a (LFA-1α) 和 CD18 (LFA-1β) 组成的异源二聚整合素。在小鼠中，LFA-1 存在于 CD103– 肝脏驻留 TRM 上，并且人们认为它引起结合肝窦内皮细胞上的 CD54 (ICAM-1)。尚不清楚这种标志物是否在人肝脏驻留 TRM 上表达 [13]。

CD44：CD44 是一种含有 C-外源凝集素的糖蛋白，这种糖蛋白在白细胞和其他细胞类型上表达并充当透明质酸 (HUA) 的受体,透明质酸是血管内皮细胞和其他免疫细胞产生的胞外基质组分 [11]。CD44 还结合其他基质蛋白，如纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原 [11]。在小鼠中,认为 CD44 是在 TRM 生物学中具有功能作用的核心标志物。然而，其表达并不区分 TRM 亚群与其他 CD8+ T 细胞群，它主要用作 T 细胞早先活化的标志物，因为它还标记 TCM 和 TEM [11]。CD44 在 TRM 中的作用可以包括调节细胞间相互作用、细胞黏附、迁移或淋巴细胞活化。

TRM 表面标志物特征

哥伦比亚大学医疗中心的 Farber 实验室已报道了一种核心 TRM 表面标志物特征，这种特征跨诸组织和不同人类供体中一致并且在 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞中均表达 [7]。在他们的方法中，鉴定 TRM 为 CD69+，而 TEM 为 CD69–。与 CD69– TEM 相比时，CD69+ TRM 显示出上调的 CD103 (整合素 αE)、CD49a (整合素 α)、CRTAM (CD355)、CD186 (CXCR6)、CD279 (PD-1)、MKP3 (DUSP6) 和 IL-10 表达。值得注意的是，CD186 (CXCR6) 的表达引起向外周组织中迁移。此外，CD69+ TRM 显示相对于 CD69– TEM，S1PR1、CD62L、CX3CR1 和 KLF2 表达上调，一个与 T RM 留存于组织内部相一致的表型 [7,9]。

CD8+ CD69+ TRM 中特异性表达的其他目的标志物是 ICOS 和 IRF4 [7]。与肺和脾脏中的 CD4+ TRM相比，CD101 还在 CD8+ TRM 上调并且可能参与抑制 T 细胞活化和增殖 [7,9]。CD28 和 CD127 (IL-7R) 可能用于阐释细胞活化和稳态 [4]。TRM 的 发育和维护受 CD122 (IL-15R) 和 CD127 (IL-7R) 调控，并且后一种受体在大多数的 CD69+ T RM 上表达 [6]。其他归巢和留存标志物可用于区分特定区室中的 TRM，如皮肤驻留 TRM上的 CLA (CD162、PSGL-1)、CCR8、CCR10、FABP4 和 FABBP5、肠驻留 TRM 上的CCR9 和整合素 α4β7 (LPAM-1) [5]。

正在进行 TRM 转录性调控研究。或许，由于它们的多样化组织分布随无数代谢生境变化而变化，目前认为 TRM 依赖于诸转录因子的组合，并且尚未鉴定统一性谱系限制型主调节者 [11]。也就是说，已经鉴定几种转录因子对 TRM 组织驻留性重要。据报道 TGF-β 信号转导后 TRM 下调 T 盒转录因子 EOMES (负向) 和 T-bet (低) [5,6,14]。RUNX3 增强了颗粒酶 B 和 CD103 表达，而 NOTCH1 似乎调节 TRM 中的代谢 [6]。其他转录因子可能促进组织驻留性程序，如 BLIMP-1 和 HOBIT，这些转录因子可以抑制 CCR7、S1PR1、KLF2 和 TCC-1 表达 (但一些报道表明 HOBIT 在 TRM 中的作用可能有限) [5,9]。目前的研究重点是鉴定出调节 TRM 的通用信号转导通路和组织特异性信号转导通路的组分。

TRM 的流式细胞术检验组合

考虑到这些数据，TRM 的流式细胞术检验组合可能包括一套核心标志物，如 CD45、CD69、CD3、CD4、CD8、CD279 (PD-1)、CD103 (整合素 αE)、CD186 (CXCR6)、CD19 (阴性)、CD45RA (阴性)、CCR7 (阴性) 和 CD62L (阴性) (图 1)。通过检验组合中纳入 CX3CR1 标志物和 S1PR1 标志物将会做出进一步澄清 [6]。CD44 用于小鼠 TRM 检验组合中 [9]。TRM 也可能上调 CD28 和 CD127 (IL-7R)，尽管这种上调似乎依赖于组织局限化 [7,8]。使用 KLRG1 和 CD27，可以鉴定其他的记忆表型。组织特异性归巢标志物，如 LFA-1、CCR8、CCR10、CLA、FABP4、FABP5、CCR9 和整合素 α4β7 (LPAM-1) 也可能有意义 [6]。

图1.TRM 的流式细胞术检验组合示例。C57BL/6 小鼠淋巴结细胞用 Invitrogen eBioscience CD3 eFluor 450、CD44 PE-eFluor 610、CD25 PE、CD62L Super Bright 780、CD4 FITC、CD8 PerCP-eFluor 710 和 CD69 APC 单克隆抗体染色。使用 Invitrogen eBioscience 可固定活力染料 eFluor 506 测定细胞活力。对于分析，从单态门控细胞 (A)小鼠淋巴结细胞(B) 中圈选出活的 CD3+ T 细胞 (C)。这些 CD3+ T 细胞依据 CD44+ 和 CD25- 表达 (分别为记忆和活化 /Treg 表型标志物) (D)圈选，然后圈选成 CD4+ 亚群和 CD8+ 亚群 (E)。CD69 和 CD62L 表达鉴定出 CD4+ 群体 (F) 和 CD8+ 群体 (G)中的 TRM 细胞 (CD69+ CD62L–)、TCM 细胞 (CD69– CD62L+) 和 TEM 细胞 (CD69– CD62L–)。仅供科研使用。不可用于诊断程序。不得转售。Super Bright 聚合物染料依据 Becton, Dickinson and Company 的许可销售。

流式细胞术检验组合的抗体选择工具

TRM 是在肿瘤学中、可能在其他疾病研究中和疫苗设计中的一个重要而不断涌现的亚群。需要进一步的研究来阐明其发育以及在疾病防范和进展中的作用。表 1 列出了用于 TRM 研究的精选 Invitrogen 流式细胞术抗体和抗体偶联物。搜索我们完整的一抗和二抗产品组合。

表 1.用于组织驻留记忆 T  细胞研究的 Invitrogen 流式细胞术抗体和精选抗体偶联物。

标志物类型标志物位置备注克隆 (精选* 货号）
小鼠
核心标志物CD69表面存在于大多数 TRM 中；还由活化的细胞表达H1.2F3 (12-0691-82)
通用表型 (非组织特异性)CD45表面淋巴细胞通用标志物30-F11 (12-0451-82)
CD3表面T 细胞通用标志物145-2C11 (12-0031-82)；17A2(12-0032-82)；eBio500A2 (12-0033-82)
CD4表面CD4+ T 细胞亚群标志物GK1.5 (12-0041-82)；RM4-5 (12-0042-82)；RM4-4 (12-0043-82)
CD8表面CD8+ T 细胞亚群标志物53-6.7 (12-0081-82)
CD279 (PD-1)表面TRM 上高表达J43 (12-9985-82)；RMP1-30 (12-9981-82)
CD101表面TRM 亚群Moushi101 (12-1011-82)
CD11a表面LFA-1 的亚基M17/4 (12-0111-82)
CD44表面表达梯度：初始 < 效应 < 记忆性 T 细胞IM7 (12-0441-82)
CD127 (IL-7R)表面TRM 亚群A7R34 (12-1271-82)
KLRG1表面TRM 上阴性表达或低表达2F1 (12-5893-82)
CCR7 (CD197)表面TRM 上阴性；由 TCM 表达4B12 (12-1971-82)
CD62L（L-选择素）表面TRM 上阴性；由 TCM 表达MEL-14 (12-0621-82)
CD45.1
CD45.2		表面可以用于异种共生研究A20 (12-0453-82)
104 (12-0454-82)
Blimp-1胞核 5E7 (12-9850-82)
黏膜部位和屏障部位CD103 (整合素 αE)表面TRM 亚群2E7 (12-1031-82)
皮肤和肝脏CD186 （CXCR6）表面TRM 亚群DANID2 (12-9186-82)
皮肤CD183 （CXCR3）表面 CXCR3-173 (12-1831-82)
肝LFA-1表面 M17/4 (12-0111-82)；M18/2 (12-0181-82)
人
核心标志物CD69表面存在于大多数 TRM 中；还由活化的细胞表达FN50 (12-0699-42)
通用表型 (非组织特异性)CD45表面淋巴细胞通用标志物HI30 (12-0459-42)；2D1 (12-9459-42)
CD3表面T 细胞通用标志物UCHT1 (12-0038-42)；SK7 (12-0036-42)；OKT3 (12-0037-42)；HIT3a (12-0039-42)
CD4表面CD4+ T 细胞亚群标志物RPA-T4 (12-0049-42)；OKT4 (12-0048-42)；SK3 (12-0047-42)
CD8表面CD8+ T 细胞亚群标志物RPA-T8 (12-0088-80)；OKT8 (12-0086-42)；HIT8a (12-0089-42)；SK1 (12-0087-42)
CD45RA表面初始 T 细胞标志物；TRM 上阴性HI100 (12-0458-42)
CD45RO表面记忆 T 细胞标志物UCHL1 (12-0457-42)
CD279 (PD-1)表面TRM 上高表达MIH4 (12-9969-42)；eBioJ105 (14-2799-80)
CD127 (IL-7R)表面TRM 亚群eBioRDR5 (12-1278-42)
NOTCH1胞内可能的 TRM 代谢标志物mN1A (12-5785-82)
CRTAM (CD355)表面在一些 TRM 亚群表面上调 (黏附分子)Cr24.1 (12-3559-42)
S1PR1 (CD363)表面在 TRM 表面下调SW4GYPP (50-3639-42)
CX3CR1表面相比循环型 TRM 在 TRM 表面下调2A9-1 (12-6099-42)
CCR7 (CD197)表面TRM 上阴性；由 TCM 表达3D12 (12-1979-42)
CD62L（L-选择素）表面TRM 上阴性；由 TCM 表达Dreg-56 (12-0629-42)
CD101表面TRM 亚群BB27 (14-10119-82)
黏膜部位和屏障部位CD103 (整合素 αE)表面TRM 亚群B-Ly7(12-1038-42)
肺和皮肤CD49a (整合素 α1)表面 TS2/7 (46-9490-42)
肺CD183 （CXCR3）表面 CEW33D (12-1839-42)
皮肤CD194 (CCR4)
CLA		表面 D8SEE (12-1949-42)
HECA-452 (50-9857-82)
淋巴结CD184 (CXCR4)
CD185 (CXCR5)		表面 12G5 (12-9999-42)
MU5UBEE(12-9185-42)
肝LFA-1表面 HI111 (11-0119-42)；6.7 (12-0189-42)；R3.3 (BMS103FI)
*抗体可作为几种不同的偶联物提供并可按多种包装提供；请访问 thermofisher.com/antibodies 查看完整列表。

参考文献

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精选抗体偶联物

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