光谱流式荧光染料选择指南

在此，我们提供了关于如何选择荧光染料和其他试剂进行光谱流式细胞术分析的指南。

设计和构建光谱流式实验方案  光谱流式细胞术基本原理

流式仪器的快速发展与越来越多的荧光标记和读数相结合，扩大了传统流式的检测能力和应用领域。现在利用全光谱流式细胞分析，科学家们可以使用流式细胞术研究越来越多的蛋白分子。重要的是，完成多色检测组合需要认真选择荧光染料、荧光试剂及荧光蛋白。在这里，我们主要介绍如何选择全光谱流式相关的荧光染料和流式抗体，探索细胞生物学、免疫学、肿瘤生物学、微生物学和植物生物学的科学研究。

随着流式细胞术的发展和提流式实验复杂性的提高，不同的支持技术正在满足他们的科学需求。研究人员开始转向光谱流式分析仪， 例如 Cytek Biosciences 提供的 Cytek Aurora 光谱流式细胞仪或 Sony Biotechnology 提供的 SA3800。光谱流式细胞仪利用每个荧光分子的固有发射模式来生成独特的光谱特征（ 图 1-3中的比较示例）。但是，每台仪器都有不同的激光器配置和光学灵敏度。在设计多色实验方案和选择合适的荧光染料组合时，了解这些差异至关重要。在任何情况下，都需要单独的荧光参考对照，类似于传统流式细胞术中的单色对照，以便对多色检测组合中的光谱特征进行数据解析。因此，光谱流式细胞术分析依赖于对独特光谱特征的区分，而不是特定的发射通道进行检测，从而实现了许多以前难以或不可能分离的荧光组合的兼容性和区分，如 PerCP 和 PerCP-eFluor 710 所示（图1）。

备注：对于每个激光器，生成的每个光谱特征（图 1-3）显示事件的分布作为整个光谱中强度的函数。解释每个通道的配色方案类似于热图或密度图的配色方案。红色代表大多数有荧光事件的强度，而黄色、绿色和蓝色代表事件数量的减少。每个激光器的检测器都可以捕获额外的发射光，从而区分荧光染料，如红色框所示。然而，基于此信息，以相似波长发射的染料可以将荧光扩散引入其他染料。有关在荧光染料之间引入的扩散值的信息，请参阅 有效流式实验方案设计工具 设计。

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图 1.大分子蛋白质与其偶联染料的比较。 （A）。从 荧光光谱查看器中可以看出，PerCP 和 PerCP-eFluor 710 的激发光和发射光谱有显著的光谱重叠。（B）。PerCP 阳性细胞（上图）与 PerCP-eFluor 710 阳性细胞（下图）在 3 激光光谱流式细胞仪* 系统上的分析比较。尽管发射值非常相似，但远红通道中的独特模式可区分这两种分子。

立即查看：Bigfoot 全光谱流式细胞分选仪

在光谱流式实验中可以更容易地联合使用各种等级的荧光探针和试剂。例如，当可用的标记试剂有限时，在更大的免疫表型分析实验方案中，Invitrogen Alexa Fluor 647 染料现在可以与更大的荧光蛋白（例如 APC）联合使用（图 2）。当扩展流式配色方案以识别亚谱系细胞类型和相关标志物时，紫激光可激发 Super Bright 标记抗体，可以与 eFluor 450 和 Pacific Orange 等传统染料联合使用。流式抗体配色方案是免疫表型分析实验的基础，但在传统流式仪器上更多色方案中加入 CellTrace 等功能性染料可能具有挑战性。但利用其独特的光谱特征，光谱流式细胞仪可以更简单地加入这些功能试剂。Invitrogen 荧光试剂和相关试剂盒非常适合快速发展的光谱细胞分析领域，使细胞生物学家、免疫学家和癌症生物学家能够探讨更深入的生物学奥秘。

图 2.相兼容的两种荧光染料示例。APC（上图）和 Alexa Fluor 647（下图）现在在 3 激光光谱流式细胞仪上分析时兼容*。尽管发射光谱相似，但它们在紫色和蓝色通道中不同的光谱特征可区分两种染料。

Invitrogen 可提供多种功能性荧光染料，帮助阐明不同的生物学机制，例如细胞周期阶段、重要的细胞信号通路、细胞凋亡导致的细胞死亡、RNA 检测等。将这些荧光染料与抗体染色组合使用时需要仔细校准和适当的生物学对照。由于细胞自发荧光会干扰某些流式方案中的荧光检测，因此光谱流式细胞仪能够在分析过程中识别和去除自发荧光（参见图 3 中的 Invitrogen PrimeFlow RNA 示例）。在光谱解析过程中，可以去除自发荧光，以便更好地解析和识别来自相关荧光染料的真实信号。光谱流式实验中抗体标记与功能性荧光染料的联合应用能够进一步阐明更复杂和深入的生物学现象。

图 3.自发荧光提取示例。PrimeFlow RNA 检测用于标记人 U937 细胞中的 mRNA。细胞用 PrimeFlow RNA 检测试剂盒处理，在 3 激光光谱流式分析仪*（图 A）上检测未染色或染色的样品。将未染色的细胞与染色的细胞混合，并在去除自发荧光前后进行分析（图 B）。

了解更多信息：BioProbes 期刊文章 — 流式细胞术检测 RNA 靶标的 PrimeFlow RNA 检测

与传统流式细胞术一样，光谱流式细胞术能够进行活细胞分析，这在免疫学 研究领域至关重要。例如，当进行 肿瘤微环境研究时，利用流式细胞仪检测细胞因子的表达、评估肿瘤特异性抗原、发现免疫检查点、CAR T 细胞治疗等是非常有效的分析方法。设计光谱流式实验方案时需要了解 仪器功能、细胞谱系亚群及其标志物、它们的预期抗原密度以及可用的流式抗体及其特性。下表中提供的信息旨在指导研究人员在使用 Cytek Aurora 3 激光器系统时为多色流式实验方案选择合适的荧光染料。

表 1.光谱流式配色方案中同时使用的 20 个 Invitrogen 荧光染料的扩散矩阵。一种可显示染料之间扩散水平的荧光染料矩阵。每行的荧光染料影响该荧光染料在列中的扩散。尽管矩阵中的所有染料都可以一起使用，但较深的红色阴影表示一种荧光染料向另一种荧光染料的扩散已经增加了，在设计流式实验和解释数据时需要更加注意。

单击每个单元格以查看光谱特征的比较和染料交叉染色指数的降低百分比。光谱特征的比较是一种荧光染料可能对另一种荧光染料产生影响的良好指标，而染料交叉染色指数的降低百分比旨在用作分辨率的定量指标。通过了解一个荧光染料的扩散（行）对另一个荧光染料（列）分辨率的影响，选择可以联合使用的合适的荧光染料要简单得多。在这个矩阵中，所有荧光染料都是标记了相同的抗原 (CD4) ，旨在成为配色方案设计中的一个有价值的参考资料。

表 2.光谱流式实验中 24 个荧光染料的复杂指数矩阵 当使用额外的荧光染料扩展流式实验方案时，请参考下面的荧光染料矩阵，它展示了染料之间的荧光扩散水平。每行的荧光染料影响该荧光染料在列中的扩散。尽管矩阵中的所有染料都可以一起使用，但较深的红色阴影表示一种荧光染料向另一种荧光染料的扩散已经增加了，在设计实验方案和解释数据时需要更加注意。

表 3.不推荐在光谱流式实验中一起使用的 Invitrogen 试剂。上述扩散矩阵中的所有荧光染料都可以一起使用。然而，根据实验的需要和可用的流式抗体，可能需要进行调整。设计流式实验方案时，请参考下表作为指南。每个单元格都包含一系列不建议一起使用的荧光染料和活性染料。