脂肪酸类似物和磷脂—第 13.2 节

本页内容

• 荧光脂肪酸类似物
• ADIFAB 脂肪酸指示剂
• 含 BODIPY 染料标记酰基链的磷脂
• 含 DPH 标记酰基链的磷脂
• 含 NBD 标记酰基链的磷脂
• 含芘标记酰基链的磷脂
• 含荧光或生物素化头部基团的磷脂
• 用于高内涵筛选的 LipidTOX 磷脂和中性脂质染色剂
• 数据表
• 订购信息

本节以及 鞘脂，类固醇，脂多糖和相关探针中的探针—第 13.3 节 中的探针与天然脂质的结构相似。本节包括荧光脂肪酸类似物以及被荧光脂肪酸酯取代其中一种或两种脂肪酸酯的磷脂。这些探针中的荧光基团往往埋在脂质双分子层膜的疏水性内部。 在该位置时，它们对膜特性敏感，如脂质流动性，侧向结构形成和蛋白质，药物和其他添加剂的结构扰动。本节还包括几种头部基团修饰的磷脂类似物，其中包括加入的荧光团或生物素（含标记头部基团的磷脂—表 13.1）。

在 鞘脂，类固醇，脂多糖以及相关探针—第 13.3 节讨论了鞘脂，类固醇和脂多糖。荧光磷脂酰肌醇衍生物作为信号转导探针的重要应用和作为磷脂酶底物的各种荧光磷脂在脂质代谢和信号转导探针—第 17.4 节中做了进一步说明。发表了对荧光脂质探针及其在生物和生物物理研究中的应用的综述。

我们的荧光脂肪酸类似物的荧光基团连接在脂肪酸链内部，或者更常见的是连接在距离羧基酸最远的末端 (omega) 碳原子上。虽然荧光脂肪酸类似物有时用作膜和脂质体的直接探针，但其最常见的应用是合成荧光磷脂以及活细胞的代谢掺入。我们的荧光脂肪酸目前包括基于 BODIPY、硝基苯甲恶唑 (NBD)、芘和丹磺酰荧光基团的衍生物以及天然荧光多不饱和脂肪酸，顺式十八碳四烯酸。

BODIPY 脂肪酸

迄今为止，BODIPY 脂肪酸是我们所获得的荧光性最强的脂肪酸类似物。 BODIPY 荧光基团无离子电荷对于长波长荧光染料来说是不常见的，因此导致荧光基团只能在膜内定位（图 13.2.1F）。BODIPY 衍生物的消光系数通常大于 90,000 cm^-1M ^-1，最大吸收波长超过 500 nm。BODIPY 染料的一个有用的光谱特性是激发态二聚体（"准分子"）的浓度依赖性形成，具有红移发射。我们观察到了这种现象，特别是在我们的绿色荧光 BODIPY 脂肪酸衍生物的使用中，当其代谢掺入亲脂性产品时，其发射波长发生了相当大的红移化 ()。芘脂肪酸 (见下文) 也显示激发态二聚体形成，但其发射波长比 BODIPY 染料的波长更短，因此不适合活细胞研究。我们当前选择的 BODIPY 脂肪酸荧光基团及其最大吸收/发射波长（单位：nm）如下：

• BODIPY 503/512 (BODIPY FL ； D3821， D3822， D3834)
• BODIPY 500/510（D3823，图 13.2.2）
• BODIPY 558/568 (D3835)
• BODIPY 581/591 (D3861)

BODIPY 脂肪酸是各种荧光磷脂的合成前体（如下所述），也是鞘脂，类固醇，脂多糖和相关探针—第 13.3 节中所述的几种重要鞘脂探针的合成前体。一些 BODIPY 脂肪酸很容易被活细胞代谢为磷脂、二酰和三酰甘油、胆固醇酯和其它天然脂质。 通过 HPLC 对细胞脂质提取物进行的分析表明，甘油磷酸盐占BHK 细胞生物合成 BODIPY 500/510 十二烷酸 (D3823) 掺入的产物的 90% 以上。

三种 BODIPY 500/510 探针形成一个独特系列，绿色荧光基团位于脂肪酸链中，与末端羧酸基团的距离不同。 探针的总长度为恒定，包括荧光基团在内，约等于 18 碳脂肪酸(图 13.2.2)。

BODIPY 581/591 十一酸 (D3861) 特别适用于检测细胞内和细胞膜中的活性氧。 BODIPY 581/591 染料的多不饱和丁间二烯基部分经氧化后会截断偶联的 π 电子系统，从而导致荧光发射峰从 590 nm 偏移至 510 nm。 这种氧化反应机制与天然存在的多不饱和脂肪酸顺式十八碳四烯酸相似（参见下文）。与顺式十八碳四烯酸相比，BODIPY 581/591 十一酸的优势包括：

• 长波激发，与共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞仪兼容
• 避免紫外光激发引起的光氧化效应
• 检测探针荧光时，彩色氧化剂和抗氧化剂添加剂的干扰更小
• 抗自发氧化性更强
• 红绿荧光偏移可以使用荧光比率检测方法

检测脂质过氧化的另一种方法是，采用 BODIPY FL 染料标记的脂肪酸氧化诱导浓度依赖性激发二聚体形成的减少。

NBD 脂肪酸

硝基苯并恶唑 (NBD) 荧光基团的荧光对其环境高度敏感。虽然它在非质子溶剂中发出中度荧光，但在水性溶剂中，其几乎不发荧光。 NBD 荧光基团具有中度极性，其同源的 6 碳和 12 碳脂肪酸类似物以及从这些探针中获得的磷脂往往能感应膜的脂质水界面区域而不是疏水性内部  (图 13.2.1B)。可利用 NBD 脂肪酸的环境敏感性探测脂肪酸和甾醇载体蛋白的配体结合位点。 NBD 脂肪酸不能很好地被活细胞代谢。

芘脂肪酸

疏水性芘荧光基团容易适应膜内。 1975 年 Galla 和 Sackmann 首次描述了长链脂肪酸的 ω-芘衍生物。 合成了 4-、10、12 和 16 碳脂肪酸的芘衍生物。芘丁酸（通常称为芘丁酸）很少用作膜探针；然而，其偶联物具有极长的激发状态寿命 （τ >100 纳秒），因此可用于时间分辨荧光免疫检测和核酸检测。 芘丁酸的长激发状态寿命也可用作细胞  和脂质囊泡中氧气的探针。

芘衍生物形成激发状态二聚体（激发二聚体），具有荧光发射红移  （图 13.2.3）当两个芘由一个短三甲基吡咯间隔连接时，甚至可以形成芘激发剂，如 1,3-双-(1-芘基) 丙烷（其他非极性和两亲性探针—第 13.5 节）。芘激发物的形成通常用于检测膜融合  （膜融合的脂质混合试验—注 13.1）以及检测脂质结构域的形成。 芘脂肪酸经活细胞代谢整合到磷脂，二酰和三酰甘油和胆固醇酯中。 芘脂肪酸的其他用途包括：

• 检测脂质与蛋白质之间的相互作用 
• 引起光动力损坏 
• 研究磷脂酶 A₂ 对脂质组件的作用 
• 研究脂质转运机制和转移蛋白 
• 合成荧光鞘脂探针

丹磺酰十一酸

丹磺酰十一酸 (Dauda) 包含一个极性的，环境敏感的丹磺酰荧光基团，优先位于脂质双分子层膜的极性头部基团区域。 Dauda 与某些蛋白结合时，荧光增强 60 倍，发射光谱向较短波长大幅偏移。 此特性已被用于分析脂肪酸结合蛋白 ，还用于开发基于竞争性脂肪酸置换的荧光磷脂酶 A₂ 测定方法（用于脂质代谢和信号转导的探针第 17.4 节）。

顺式十八碳四烯酸

天然存在的多不饱和脂肪酸顺式十八碳四烯酸最初由 Hudson 和同事开发作为膜探针，并于 1975 年出版。顺式十八碳四烯酸是目前可用的荧光探针中固有膜脂结构最接近的类似物（图 13.2.1E）。 顺式十八碳四烯酸的化学和物理特性已经过良好表征。 顺式十八碳四烯酸的最低吸收带在 300 nm 和 320 nm 附近有两个主峰，具有高消光系数。顺式十八碳四烯酸具有多种实验优势光学特性，包括非常大的荧光斯托克斯位移 (~100 nm)，在水中几乎完全没有荧光。此外， 顺式十八碳四烯酸的荧光衰变寿命从 1 至 ~40 纳秒不等，这取决于磷脂双分子层中的分子填充密度。因此，可以获得关于脂质双分子层动态的详细详尽资料。

顺式十八碳四烯酸的选定应用包括：

• 脂蛋白中过氧化的测定 以及过氧化与细胞毒性 和细胞凋亡的关系
• 抗氧化剂的评估
• 对脂蛋白进行色谱分离 和结构表征后再进行检测
• 检测脂质-蛋白相互作用和脂质聚类
• 肌球蛋白亚片段-1 的重链与其必需轻链之间的疏水口袋具有高亲和力
• 研究脂肪酸结合蛋白 和磷脂转移蛋白的机制

顺式十八碳四烯酸广泛的不饱和度使其极易被氧化。因此，如果在 -20°C 下惰性氩气环境下避光储存，A3 mM 顺式十八碳四烯酸溶液在脱氧乙醇中的稳定性至少达 6 个月。在实验期间，我们强烈建议 在惰性气体下处理顺式十八碳四烯酸样品，并使用脱气缓冲液和溶剂制备溶液。顺式十八碳四烯酸也具有一定的光不稳定性，在强烈照明下进行光二聚反应，导致荧光消失。

脂肪酸结合蛋白是在多种哺乳动物组织中发现的小细胞溶质蛋白，及其生理功能的研究通常涉及荧光脂肪酸探针。 游离脂肪酸的双波长荧光指示剂 ADIFAB 有助于这些研究 （图 13.2.4， 图 13.2.5；欲了解更多信息，请联系 定制服务部门）。ADIFAB 是 I-FABP 的偶联物，一种大鼠肠道脂肪酸结合蛋白，具有低分子量 （15,000 道尔顿）和游离脂肪酸的高结合亲和力，以及极性敏感 Acrylodan 荧光基团（A433， 紫外光激发的硫醇反应性探针—第 2.3 节）。它旨在对游离脂肪酸进行定量监测，而无需单独使用生化方法。 本产品随附的产品信息表中介绍了相应的预防措施，ADIFAB 可用于测定 1 nM 至 >20 µM 之间的游离脂肪酸浓度。

BODIPY 甘油磷脂

我们提供在 sn-2 酰基链上采用单个绿色荧光 BODIPY FL 荧光基团标记的甘油磷脂类似物：BODIPY FL 染料标记的甘油磷酸胆碱 (D3792)。此外，我们还在 sn-1 位置上采用单一不可水解的乙醚连接的 BODIPY FL 荧光基团（欲了解更多信息,请联系 定制服务部门）以及几种双标记的甘油磷脂制备了甘油磷脂类似物。 这些双标记的甘油磷脂在 用于脂质代谢和信号转导的探针 - 第 17.4 节中有更详细的讨论，它们主要用于检测磷脂酶 A₁ 和磷脂酶 A₂ ，包括：

• 含 BODIPY FL 染料标记 sn-1 酰基链和二硝基苯淬灭剂修饰头部基团的甘油磷酸乙醇胺 (PED-A1, A10070)
• 含 BODIPY FL 染料标记 SN-2 酰基链和二硝基苯淬灭剂修饰头部基团的甘油磷酸乙醇胺 （PED6， D23739；图 13.2.9）
• 含两条 BODIPY FL 染料标记酰基链的甘油磷酸胆碱（Bis-BODIPY FL C₁₁-PC， B7701；图 13.2.9）
• 含 BODIPY 558/568 染料标记的 SN-1 烷基链和 BODIPY FL 染料标记的 sn-2 酰基链（红色/绿色 BODIPY PC-A2， A10072）的甘油磷酸胆碱

BODIPY FL 染料标记的磷脂的光谱特性汇总见 一些脂质探针的光谱特性—表 13.2。与硝基苯并恶唑 (NBD) 荧光基团不同， BODIPY FL 和 BODIPY 500/510 荧光基团本质上亲脂性，且易于定位于膜的内部。 荧光基团无法完全与膜不可透过性抗 BODIPY FL 抗体 结合（A5770， 抗染料和抗半抗原抗体—第 7.4 节），该抗体也可识别 BODIPY 500/510 衍生物。如 图 13.2.6所示，BODIPY 500/510 荧光基团的发射光谱较 NBD 荧光基团更窄。由于 BODIPY 500/510 荧光基团的消光系数及其在亲脂性环境（EC ~90,000 cm^-1M^-1 和 QY ~0.9）中的量子产率均比 NBD 荧光基团 (EC ~20,000 cm^-1M^-1 和 QY ~0.3）高得多，因此标记膜所需的 BODIPY 500/510 染料标记磷脂要少得多。

将高摩尔比例 (10 mole %) 的>BODIPY 500/510 染料标记的磷脂与膜结合，导致荧光发射光谱向更长的波长发生剧烈的光谱位移（图 13.2.7）。我们还观察到了活细胞高尔基体中的这种光谱位移，这些细胞已被 BODIPY 染料标记的宫酰胺 (用于内质网和高尔基体的探针—第 12.4 节）和经细胞代谢掺入的 BODIPY 脂肪酸标记 （）。在荧光共振能量转移 (FRET) 测量中，绿色荧光 BODIPY 500/510 染料是波长较长的 BODIPY 探针的优良供体 （图 13.2.8）和丹磺酰基、DPH或芘标记的磷脂的受体。 这些探针组合为使用 FRET 技术研究脂质转移和膜融合的研究人员，提供了广泛使用的 NBD–罗丹明荧光基团对的多种替代品。

应用

一旦用 BODIPY 磷脂标记细胞，探针就几乎不会在细胞之间自发转移。 因此，BODIPY 染料标记的磷脂已用于许多细胞膜结构和特性的研究：

• 尽管 BODIPY 脂质具有良好的光稳定性，但在脂质扩散测量后，其可用于光脱色荧光恢复技术 (FRAP)。
• 研究人员已使用 BODIPY 脂肪酸和磷脂对 曼森氏血吸虫病  和真菌中特定脂类的分区进行观察。
• β-BODIPY FL C₁₂-HPC (D3792) 已用于通过荧光共振能量转移(FRET) 测量检查与细菌蛋白分泌有关的脂质-蛋白相互作用  （荧光共振能量转移 (FRET) —注 1.2）。
• β -BODIPY FL C₅-HPC  已用于通过荧光相关光谱  （荧光相关光谱 (FCS) - 注 1.3），共聚焦激光扫描显微镜  ()和近场扫描光学显微镜表征脂质结构域。
• β-BODIPY FL C₅-HPC 已用于研究抗肿瘤醚脂类的细胞摄取。
• Bis-BODIPY FL C₁₁-PC (B7701) 具有 BODIPY FL 染料标记 sn-1 和 sn-2 酰基团，当磷脂酶 A₁ 或 A₂水解其中一个酰基团时，会导致部分淬灭的荧光增加。水解产物为 BODIPY FL 十一酸和 BODIPY FL 染料标记的溶血磷脂胆碱（图 13.2.9）。该探针已成功用于人中性粒细胞，植物和斑马鱼以检测磷脂酶 A 活性  （用于脂质代谢和信号转导的探针—第 17.4 节）。

特性

荧光磷脂类似物 β -DPH HPC 由二苯基己三烯丙酸组成，在 sn-2 位置上与甘油磷酸胆碱偶联。因此，它与中性膜探针 DPH 和阳离子衍生物 TMA-DPH （T204， 其他非极性和两亲性探头—第 13.5 节）有关。DPH 及其衍生物在掺入膜时显示出强烈的荧光增强，以及对脂质排序产生敏感的荧光偏振（各向异性）反应（荧光偏振 (FP)—注 1.4）。β-DPH HPC 最初设计用于改善 DPH 在膜中的定位。 与未衍生化 DPH 不同，它可用于特异性标记脂质双分子层的一小叶，以促进膜不对称性的分析。

应用

DPH 衍生物主要用于通过荧光偏振或寿命测量研究膜内部的结构和动力学。研究人员已经使用 β -DPH HPC 作为脂质-蛋白相互作用、 酒精诱导的膜结构、 脂质双分子层分子组织和动力学扰动 以及脂质过氧化反应的探针。 β-DPH HPC 的荧光寿命测量提供了膜融合的灵敏指示剂。 除了膜融合外，还使用了 β -DPH HPC 来监测各种其他脂质转移过程。

特性

一些脂质探针的光谱特性—表 13.2 比较了 经正甲基修饰的硝基苯并恶唑 (NBD) 磷脂探针 NBD C₆-HPC 和 NBC C₁₂-HPC 与 BODIPY，DPH 和芘脂质探针的光谱特性。与 BODIPY 磷脂不同，NBD C₁₂-HPC 在磷脂双分子层中相对极性 NBD 荧光基团的位置似乎 不 符合预期（基于探针结构）。多种物理证据表明 NBD 部分可 "回" 到头部基团区 （图 13.2.1B）。事实上，这种酰基修饰磷脂中的荧光基团似乎可探测与头部基团标记的甘油磷酸乙醇胺衍生物 NBD-PE （N360，见下文）相同的位置。

这些 NBD 探针在膜之间自发转移，且 NBD C₆-HPC 转移比其亲脂性更强的 C₁₂ 类似物更快。 NBD C₆-HPC 可通过用未标记的脂质囊泡 或牛血清白蛋白孵育标记的细胞，轻松从质膜中去除（反向交换）。 该属性可用于定量脂质转移，并研究脂质双层中磷脂分布的不对称性和跨膜 "翻转" 速率。

应用

NBD 酰基修饰的探针用于研究脂质迁移，通过直接观察 NBD 荧光、 利用 NBD 自淬灭 或荧光共振能量转移方法进行研究。 已经使用 NBD 磷脂结合光漂白后荧光恢复 (FRAP)、荧光共振能量转移 ( FRET)（荧光共振能量转移 (FRET)—注 1.2）和直接显微镜检查技术对单分子层、双分子层和细胞膜中的侧向结构域进行了表征。已使用从 NBD HPC 到罗丹明 DHPE (L1392) 的荧光共振能量转移或选择性联二亚硫酸盐 (S₂O₄^2–) 还原外膜单分子层中的 NBD 磷脂 （图 13.2.10）评估跨膜脂分布（膜融合脂质混合试验—注 131）。

特性

芘标记的 sn-2 酰基链的磷脂类似物是最常用的荧光膜探针之一。 芘脂质探针的光谱特性总结见 一些脂质探针的光谱特性—表 13.2。在实际应用中至关重要的是激发态芘二聚体 (激发二聚体) 的浓度依赖性形成，其表现出独特的红移发射波长（峰值 ~470 nm）（图 13.2.3）。

应用

芘的激基缔合物形成特性非常适合监测膜融合（膜融合脂质混合试验—注 13.1）和磷脂转移过程。 单体/激基缔合物发射比也可以用于表征膜结构域及其对温度、脂质成分和其他外部因素的依赖性。已使用芘癸酸甘油磷酰胆碱 (β -py-C 10 -HPC) 来阐明外源物种（如 Ca²⁺、 血小板活化因子、 药物、 膜相关蛋白 和乙醇） 对脂质双分子层结构和动力学的影响。与其他磷脂类相比，阴离子型磷酸甘 油类似物可优先用作分泌磷脂质酶 A₂ 的底物。 芘的长激发态寿命（某些脂质探针的光谱特性—表 13.2）可使其偶联物的荧光极易发生氧淬灭，因此这些探针可用于测量溶液、 脂质双分子层 和细胞中的氧浓度。

在甘油磷脂中，两种醇均被芘脂肪酸酯化（图 13.2.1C），如在双-(1-芘丁酰基) 甘油磷酰胆碱和双-(1-芘癸酰基) 甘油磷酰胆碱，均发出较强的激基缔合物荧光，最大发射波长近 470 nm。 磷脂酶水解其中一种脂肪酸酯后，会释放出一种芘脂肪酸，并使发射波长变短，因此使这些探针可用作磷脂酶底物 （脂质代谢和信号转导的探针第 17.4 节）。

含有丹磺酰标记头部基团的磷脂

结合了环境敏感的 丹磺酰荧光基团（丹磺酰 DHPE）的磷脂类似物是脂质-水界面的一种有用探针。 它对多种蛋白质（包括蛋白激酶 C、 膜联蛋白 和磷脂酶 A₂） 与膜表面的相互作用非常敏感。丹磺酰 DHPE 也已用于检查胆固醇对丹磺酰半抗原与抗体接触的影响 (检测膜表面标签的抗体—注 13.2)。

含 Marina Blue 染料标记头部基团的磷脂

Marina Blue DHPE (M12652) 由汞弧灯的 365 nm 强烈光谱线激发，发射波长接近 460 nm 的明亮蓝色荧光。值得注意的是，这种 6,8-二氟-7-羟基香豆素衍生物的 pK_a 值比非氟化 7-羟基香豆素类似物低 2–3 个数量级；因此，Marina Blue DHPE 即使在中性 pH 值下也有望在膜内发出强烈的荧光。

含 Pacific Blue 染料标记头部基团的磷脂

Pacific Blue 染料标记的磷脂 (Pacific Blue DMPE) 是我们唯一用十四酰基（肉豆蔻酰基）酯而非十六烷酰基（棕榈酰）酯的头部基团标记磷脂。这种蓝色荧光磷脂在结构上与 Gonzalez 和 Tsien 所述用于膜电位 FRET 测量的磷脂相似。

含 NBD 标记头部基团的磷脂

广泛使用的硝基苯甲氧二恶唑烷酰甘油磷酸乙醇胺 (NBD-PE， N360) 膜探针具有三种重要的光学特性：光漂白性，使其适用于光漂白回收测量；浓度依赖性自淬灭；以及向罗丹明受体（通常是罗丹明 DHPE， L1392）的荧光共振能量转移。NBD-PE 的光谱特性通常与 NBD 标记酰基链的磷脂相似。NBD-PE 常用于 NBD–罗丹明荧光能量转移实验，可监测膜融合（膜融合的脂质混合试验—注 13.1）。此外，该方法可用于检测脂质结构域的形成 和膜间脂质转移 以及确定磷脂的转运双分子层分布。 将 NBD 荧光基团连接到头部基团，使得 NBD-PE 可耐受囊泡之间的转移。 NBD-PE 已与罗丹明 DHPE (L1392) 或 Texas Red DHPE (T1395MP) 结合使用，通过荧光共振能量转移显微镜观察脂质群体的空间关系。 NBD 的硝基基团可以用二硫酸钠还原，不可逆地消除染料的荧光（图 13.2.10）。可以采用这种技术来确定探针是位于细胞膜的外叶还是内叶上。 氩离子激光激发的 NBD-PE 也是膜侧向扩散光漂白 (FRAP) 测量后荧光回收的常见选择。 此外，NBD-PE 特别适用于监测双分子层到六角相相变，因为这些转换会导致 NBD-PE 的荧光强度增加。

含荧光素标记头部基团的磷脂

荧光素衍生的二十六烷酰甘油磷酸乙醇胺（荧光素 DHPE，F362）是一种对局部静电电位和 pH 值均敏感的膜表面探针。 抗荧光素/Oregon Green 染料抗体 (A889， 抗染料和抗半抗原抗体—第 7.4 节) 已与荧光素 DHPE 结合使用以研究膜表面的特异性识别相互作用 （检测膜表面标记的抗体—注 13.2）。

由于荧光素具有光可应用性，荧光素 DHPE 是使用荧光光致漂白恢复方法测量膜中侧向扩散的有用试剂。 另一种技术 [单一颗粒追踪 (SPT)] 通过从时间顺序图像中计算荧光聚苯乙烯微珠或胶体金颗粒的轨迹，提供扩散率的直接测量方法。 用链霉亲和素标记 FluoSpheres 荧光微球（微球—第 6.5 节），然后通过抗荧光素/Oregon Green 单克隆 4-4-20 的生物素化偶联物（A6421， 抗染料和抗半抗原抗体—第 7.4 节）偶联至荧光素 DHPE。在玻璃支持的磷脂双分子层中，使用这种桥接偶联物测定的扩散率与使用直接偶联生物素-X DHPE 的链霉亲和素微珠确定的扩散率相同。荧光素 DHPE 还与多克隆抗荧光素 /Oregon Green 染料抗体 (A889， 抗染料和抗半抗原抗体 (7.4 节) 结合使用，以制备胶体金探针，用于在支持的磷脂双分子层和角膜细胞质膜中的 SPT 扩散测量。

含 Oregon Green 488 染料标记头部基团的磷脂

凭借几乎不可与荧光素叠加的吸收和发射光谱，我们的 Oregon Green 488 DHPE (O12650) 在其许多应用中为荧光素 DHPE 提供了重要的替代物。与荧光素衍生物相比，Oregon Green 488 DHPE 的光稳定性更高，pK_a 较低（pK_a = 4.7 vs 荧光素 6.4）；然而，当探针与膜结合时，这些 pK_a 的值可能不同。

含 BODIPY FL 染料标记头部基团的磷脂

我们的磷脂含有与头部基团连接的绿色荧光的 BODIPY FL 染料 (BODIPY FL DHPE ， D3800)，在研究膜表面分子识别相互作用方面具有重要的潜力（检测膜表面标记的抗体—注 13.2）。此 BODIPY 探针的光谱特性通常与上述使用 BODIPY FL 染料标记酰基链的磷脂的光谱特性相同。

使用罗丹明或 Texas Red 染料标记头部基团的磷脂

罗丹明标记的磷脂 TRITC DHPE 和罗丹明 DHPE（通常称为 N-Rh-PE， L1392； 图 13.2.1G）不会在分离的脂双分子层之间轻松转移。 这种特性使罗明丹 DHPE 被广泛应用于基于 NBD-PE 的荧光共振能量转移的膜融合检测（膜融合的脂质混合试验—注 13.1）。此外，这些探针是荧光脂质类似物（如 BODIPY 和 NBD 磷脂 和蛋白质标签（如 5-碘乙酰氨基荧光素 5-IAF，I30451）用可见光激发的硫醇反应性探针—第 2.3 节）和 IAEDANS （I14， 用紫外光激发的硫醇反应性探针—第 2.3 节）。罗丹明标记的磷脂也被用作内吞作用期间膜运输 和肝细胞脂质加工的示踪剂。 Texas Red DHPE (T1395MP) 主要用作 NBD、BODIPY 和荧光素脂质探针的能量转移受体。Texas Red 染料的发射波长较长，可在共振能量转移显微镜检查中出色分离供体和受体发射信号。 这一技术已经可以观察脂质体与高尔基体之间的 ATP 依赖性融合的情况。 通过使用 Texas Red DHPE 和亲脂性羰花青 DiI (D282， D3911 ； 二烷基碳氰酸酯和二烷基氨基苯乙烯基探针—第 13.4 节) 作为膜标记，可观察血凝素介导的细胞-细胞融合过程中的膜通量。

使用生物素化头部基团的磷脂

头部基团生物素标记的磷脂有助于将标记膜与其他生物分子结合。生物素化磷脂（生物素 DHPE，生物素-X DHPE）可用于将亲和素或链霉素亲和素（分子探针亲和素、链霉素亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 偶联物—表 7.10）偶联到细胞膜，脂质体和脂质单分子层。 然后，亲和素可以用作抗体偶联的桥，或者将脂质体组装为多通路结构。 掺入生物素化磷脂的脂质体还可用于固定膜结合蛋白，以通过亲和色谱进行分析。 生物素化脂质与链霉素亲和素的相互作用为膜表面分子识别过程提供了一个模型。 X 射线衍射，³¹P NMR 和差分扫描热量测定法已经研究了掺入生物素化磷脂质组件的相结构。

凭借基于图像的方法所固有的分辨率和高通量检测的生产率，高内涵筛选 (HCS) 或自动化成像为在空间和时间背景下研究生物学提供了强大的工具。研究人员可使用 HCS 技术在大量单个成像细胞中检测多个细胞靶标和参数，并定量评估数据。虽然许多分子探针 (Molecular Probes) 产品可以直接应用于 HCS 实验方案，但我们专为 HCS 平台开发了经过验证的工具和检测试剂盒。这些 HCS 产品包括：

• 经过多个成像平台验证
• 包装于自动化兼容配方中
• 与多重应用兼容

尽管是针对 HCS 平台而设计，但 HCS 产品和试剂盒也可与配备标准光学滤光片组的传统荧光显微镜一起使用。

HCS LipidTOX 磷脂沉积检测试剂

磷脂沉积通常由阳离子两亲药物触发，后者会在溶酶体中富集到高浓度，并抑制磷脂的正常代谢。随后，可在磷脂与荧光染料偶联的情况下，在孵育的细胞中检测到磷脂的细胞内积聚及和板层小体磷脂沉积形成。

HCS LipidTOX 绿色和 HCS LipidTOX 红色磷脂沉积检测试剂 (H34350, H34351)，也称为磷脂染料，专门开发用于使用基于图像的 HCS 检测法，表征化合物对哺乳动物细胞系中脂质代谢的潜在毒副作用。 与 NBD-PE (N360) 等常规染色剂相比，这一系列磷脂沉积检测试剂的主要优势包括即用型水溶液配方，较窄的发射光谱（HCS LipidTOX 绿色磷脂沉积检测试剂的最大激发/发射波长 ~525 nm，HCS LipidTOX 红色磷脂沉积检测试剂为 ~595/615 nm）及可与 HCS LipidTOX 中性脂质染色剂兼容（见下文）。

未观察到 HCS LipidTOX 磷脂沉积检测试剂会影响细胞的正常生长，其活细胞染色模式在甲醛固定后仍可保持。这些试剂设计用于固定端点工作流程，在该工作流程中对微孔板中的甲醛固定细胞进行处理，成像和分析。HCS LipidTOX 磷脂沉积检测试剂可通过荧光显微镜或配备标准滤光片组的 HCS 读数仪轻松检测。

HCS LipidTOX 中性脂质染料

与磷脂沉积一样，脂肪变性或中性脂质的细胞内积聚是因为脂滴或脂球,常常由影响脂肪酸或中性脂质代谢的药物触发的。HCS LipidTOX 绿色中性脂质染料被开发用于表征化合物对哺乳动物细胞系中脂质代谢的潜在毒性作用。HCS LipidTOX 中性脂质染料对中性脂滴具有极高的亲和力。在细胞固定后加入这些试剂，与样品孵育后无需后续洗涤步骤。该系列中性脂质染色剂与尼罗红(N1142， 其他非极性和两亲性探针—第 13.5 节)相比，其主要优势包括即用型配方，其多通路方案的灵活性以及与 HCS LipidTOX 磷脂沉积检测试剂的兼容性(参见上文).HCS LipidTOX 中性脂质染料也可用于监测脂肪细胞的形成和分化，该过程被称为脂肪生成。脂肪生成在肥胖，糖尿病和动脉粥样硬化等疾病中起着重要作用，因此引起了生物医学和药物发现界的急切关注。

其他非极性和两亲性探针中更彻底描述—第 13.5 节说明了 HCS LipidTOX 中性脂质染色剂可提供绿色，红色和深红色荧光发射波长：

• HCS LipidTOX 绿色中性脂质染色剂 (H34475)，最大激发/发射波长为 ~495/505 nm （图 13.2.11）
• HCS LipidTOX 红色中性脂质染色剂 (H34476)，最大激发/发射波长为 ~577/609 nm
• HCS LipidTOX 深红色中性脂质染色剂 (H34477)，最大激发/发射波长为 ~637/655 nm

HCS LipidTOX 中性脂质染料设计用于固定端点工作流程，在该工作流程中可对微孔板中的甲醛固定细胞进行处理，成像和分析。这些染色剂可通过荧光显微镜或配备标准滤光片组的 HCS 读数仪轻松检测。

HCS LipidTOX 磷脂沉积和脂肪变性检测试剂盒

在毒理学分析和化合物筛查中探测和分析致死前机制，是药物发现过程中极为重要的组成部分。阳离子间两性分子药物是影响细胞脂质代谢的化合物最显著的示例。这些药物往往在溶酶体中富集到高浓度，并抑制磷脂的正常代谢，而这反过来会导致磷脂的细胞内累积和板层小体的形成。其他药物类别会对脂肪酸或中性脂质代谢的各个方面产生更不利的影响，导致中性脂质作为脂滴或球液滴的细胞质积聚。

HCS LipidTOX 磷脂沉积和脂肪变性检测试剂盒 (H34158) 提供了一套完整的试剂，可用于执行经过验证的 HCS 分析，以在暴露于供试化合物后在哺乳动物细胞系中检测和区分细胞毒性的这两个方面—磷脂（磷脂沉积）和中性脂质（脂肪变性）的细胞内积聚。 该试剂盒包括标记磷脂的水性红色荧光配方（LipidTOX 红色磷脂染色剂，激发/发射波长为 ~595/615 nm）和用于中性脂质的即用型，高度选择性绿色荧光染色剂（LipidTOX 绿色中性脂质染色剂，激发/发射波长为 ~495/505 nm），可依次分别用于磷脂沉积和脂肪变性分析，或可单独用于单参数分析。

经 LipidTOX 红色磷脂染料和供试化合物孵育后，细胞用甲醛固定，并用 LipidTOX 绿色中性脂质染料进行标记（图 13.2.12）。上述 LipidTOX 红色磷脂染色剂和 LipidTOX 绿色磷脂染色剂均不需要超声处理或有机溶剂。此外，LipidTOX 绿色中性脂质染色剂（以及上述其他 LipidTOX 中性脂质染色剂）比尼罗红更具选择性，可让您轻松区分中性脂质（如脂肪细胞和正在进行脂肪变性的细胞中的脂肪细胞）和其他类型的脂质。

每套 HCS LipidTOX 磷脂沉积和脂肪变性检测试剂盒可提供：

• LipidTOX 红色磷脂染料
• LipidTOX 绿色中性脂质染料
• 用于核标记的 Hoechst 33342
• 普萘洛尔是一种阳性对照化合物，用于诱导磷脂沉积
• 环孢菌素 A 是一种阳性对照化合物，用于是诱导脂肪变性
• 二甲基亚砜 (DMSO)
• 详细的方案（HCS LipidTOX 磷脂沉积和脂肪变性检测试剂盒） 

按每孔 100 µL 的检测体积计算，可提供 1200 次检测所需的足够试剂（H34158，10 孔板规格）。该试剂盒设计用于固定点工作流程，在固定点工作流程中对微孔板中的甲醛固定细胞进行处理，成像和分析。用于磷脂沉积和脂肪变性分析的荧光染色剂可轻松地使用配备标准滤光片组的荧光显微镜或 HCS 读数仪进行检测。

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