线粒体标记探针—第 12.2 节

线粒体存在于真核细胞中，总量占细胞体积高达 10%。它们是多形性细胞器，结构因细胞类型、细胞周期阶段和细胞内代谢状态而异。线粒体的重要功能是通过氧化磷酸化 (OxPhos) 作用和脂质氧化反应产生能量。 线粒体可执行其他几种代谢功能，包括尿素生成和血红素，非血红素铁和类固醇生物发生，以及细胞内 Ca²⁺ 稳态。线粒体还在细胞凋亡中发挥 着重要作用 — 在正常发育过程中基因控制的细胞消亡 (第 15.5 节—细胞凋亡测定）。对于这些线粒体的许多功能，人们只需对所涉及的组分有部分了解，对其机制和调控的信息知之甚少。

线粒体的形态具有高度可变性。在分裂细胞中，细胞器可以在两种形态之间切换，一种是教科书中经常出现的由许多卵圆形线粒体组成的断裂形态，另一种是细胞为单一、多分支结构的网状形态。线粒体形态中的细胞周期和代谢状态依赖性变化由一组蛋白来控制，该蛋白质会引起裂变和细胞器质量融合。这些蛋白质中的突变是导致几种人类疾病的原因，从而表明总体形态对细胞功能的重要性（ 注 12.2—疾病中的线粒体）。细胞器形态还受到细胞骨架元件控制，包括肌动蛋白丝和微管（图 12.2-1）。在非分裂组织中，总线粒体形态非常依赖于细胞类型，精子中线粒体围绕轴丝呈螺旋状排列，线粒体的卵圆形条带穿插在肌动球蛋白丝之间。证据表明单个细胞内线粒体的形态在功能上存在着显著的异质性。

线粒体丰度随细胞能量水平而变化，是细胞类型，细胞周期阶段和增殖状态的函数。例如，棕色脂肪组织细胞， 肝细胞 和某些肾小管上皮细胞 往往富含活性线粒体，而静态免疫系统祖细胞或前体细胞很少出现线粒体选择性染料染色。 阿尔茨海默病患者的线粒体数量减少，其蛋白质和核酸很容易受到活性氧的损伤，包括一氧化氮 （第 18 章—包括一氧化氮在内的活性氧的探针）。

我们提供一系列线粒体选择性荧光蛋白和有机染料，用于监测线粒体形态和细胞器功能。与基于荧光蛋白的 CellLight 探针不同，大多数线粒体选择性有机染料的摄取取决于线粒体膜电位。因此，研究人员可以使用这些染料探测线粒体的活性、定位和丰度， 并监测一些药物的作用，这些药物可以改变线粒体的功能。 CellLight 探针可与这些有机染料结合使用，用于研究线粒体形态和膜电位之间的关系。

CellLight 线粒体-GFP （C10508， C10600， 图 12.2.2）和 CellLight 线粒体-RFP (C10505， C10601) 试剂结合了目标荧光蛋白的实用性和选择性与 BacMam 基因递送和表达技术的有效性。这些 BacMam 表达载体编码绿色荧光蛋白 (GFP) 或红色荧光蛋白 (RFP) ，与 E1α 丙酮酸脱氢酶的前导序列融合，从而将荧光蛋白靶向活细胞的线粒体。CellLight 试剂（ CellLight 试剂及其靶向序列 - 表 11.1）结合了 BacMam 技术的所有习惯优势，包括高转导效率和持久的可滴定表达（ BacMam 基因递送和表达技术 - 注 11.1）。它们以即用型方式提供只需添加、孵育和成像，可在细胞系、原代细胞、干细胞和神经元中高效表达。

可在使用 CellLight 线粒体-GFP 或 CellLight 线粒体 -RFP（图 12.2.3）转导的细胞中轻松观察有丝分裂期间的线粒体运动力。与 MitoTracker Red CMXRos、TMRE、罗丹明 123 和其他阳离子染料相比，基于荧光蛋白的标记物的线粒体定位不受膜电位驱动。 因此，它们可与阳离子染料探针配合使用，以研究线粒体形态和膜电位之间的关系。

虽然传统的线粒体荧光染色剂（如罗丹明 123 和四甲基罗丹明）可以很容易地通过功能线粒体隔离，但一旦线粒体膜电位丢失，它们随后会从细胞中洗涤出来。这一特性限制了它们在实验中的使用，在这些实验中，细胞必须用醛类固定剂或影响线粒体能量状态的其他试剂处理。为了克服这一限制，我们开发了 MitoTracker 探针—一系列线粒体选择性染色剂，它们由活性线粒体浓缩并在细胞固定过程中保留良好。 由于 MitoTracker Orange，MitoTracker Red 和 MitoTracker Deep Red 探针在透化后也可以保留，因此在免疫细胞化学技术， 原位 杂交或电子显微镜的后续处理步骤中，样品可保留活细胞的荧光染色模式特征。此外，MitoTracker 试剂消除了致病性细胞的一些困难，因为一旦线粒体染色，就可在分析样品前用固定剂处理细胞。

MitoTracker 探针的特性

MitoTracker 探针是一种细胞渗透性线粒体选择性染料，含有温和硫醇反应性氯甲基部分。氯甲基基团似乎负责在固定后维持与线粒体相关的染料。 为了标记线粒体，只需将细胞在 MitoTracker 探针的亚微摩浓度中孵育，被动扩散穿过质膜并在活性线粒体中积聚。一旦标记了线粒体，就可以使用醛类固定剂处理细胞，从而进一步处理样品；除 MitoTracker Green FM 外，随后使用冷丙酮进行的透化不会干扰 MitoTracker 染料的染色模式。

我们提供七种 MitoTracker 试剂，其光谱特性，氧化状态和固定能力各不相同（ MitoTracker 探针的光谱特性—表 12.2）。MitoTracker 以特殊包装的形式提供，每组 20 小瓶，每瓶含 50 μg，可根据要求进行重组。

橙色，红色和红外荧光 MitoTracker 染料

我们提供橙色荧光四甲基罗胺 (MitoTrackerOrange CMTMRos, M7510) 和红色荧光 X-罗氏胺 (MitoTracker Red CMXRos, M7512)，以及 MitoTracker Red FM (M22425; ) 和MitoTracker Deep Red FM 探针 (M22426; 。由于 MitoTracker Red CMXRos，MitoTracker Red FM 和 MitoTracker Deep Red FM 探针会产生较长波长的荧光，并可从绿色荧光染料的荧光中清晰分辨，因此适合多色标记实验 (, , )。还提供化学还原形式的四甲基罗胺 (MitoTracker Orange CM-H₂TMRos, M7511) 和 X- 罗氏胺 (MitoTracker Red CM-H₂XRos, M7513) MitoTracker 探针。与 MitoTracker Orange CMTMRos 和 MitoTracker Red CMXRos 不同，这些探针的还原版本在进入主动呼吸的细胞前不会发出荧光，在该细胞内被氧化为荧光线粒体选择性探针，然后再吸收到线粒体中 （图 12.2.4， ， ）。

我们的 线粒体膜电位/膜联蛋白 V 细胞凋亡试剂盒 （V35116， 细胞凋亡检测 - 第 15.5 节）利用 MitoTracker CMXRos 与 Alexa Fluor 488 膜联蛋白 V 结合，以进行凋亡细胞的双色测定（图 12.2.5）。固定后，四甲基丹明和 X-rosamine MitoTracker 染料的氧化形式可通过荧光进行直接检测，或使用 抗四甲基罗丹明 (A6397) 或 抗–Texas Red 染料 抗体（A6399； 抗染料和抗半抗原抗体—第 7.4 节）进行间接检测。

MitoTracker Green FM 染料

以纳摩浓度的 MitoTracker Green F 染料 (M7514) 染色的细胞中的线粒体会发出亮绿色荧光素样荧光 (, , )。MitoTracker Green FM 探针的附加优势是，在水溶液中基本不发荧光，在线粒体的脂质环境中蓄积后才会发出荧光。因此，背景荧光可忽略不计，使研究人员能够在加入染色剂后立即清晰地观察活细胞中的线粒体，而无需洗涤步骤。

与 MitoTracker Orange CMTMRos 和 MitoTracker Red CMXRos 不同，在某些细胞类型中，无论线粒体膜电位如何，MitoTracker Green FM 探针似乎可以优先在线粒体中蓄积，而这使其成为测定线粒体质量的可能工具。 此外，MitoTracker Green FM 染料的光稳定性显著高于广泛使用的罗丹明 123 荧光染料，可在较低浓度下产生更明亮，更多的线粒体选择性信号。由于 MitoTracker Green FM 染料的最大发射波长相对于罗丹明 123 的最大发射波长蓝移约 10 nm，因此，在双标记实验中，其产生的荧光染色模式应该可以更好地从红色荧光探针中区分。通过毛细管电泳分离经 MitoTracker Green FM 试剂选择性标记的线粒体蛋白。

线粒体超氧化物是氧化磷酸化的副产物。在另一个紧密偶联电子传递链中，线粒体消耗的氧大约 1-3% 未被完全还原；这些 "渗漏" 电子可与分子氧快速相互作用以形成超氧化物阴离子，这是线粒体中的主要活性氧簇。 细胞超氧化物生成的增加与心血管疾病相关，包括高血压，动脉粥样硬化和糖尿病相关的血管损伤， 以及神经退行性疾病，如帕金森病，阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化 (ALS)。

MitoSOX 红色线粒体超氧化物指示剂 (M36008) 是二氢乙锭的阳离子衍生物（也称为氢乙啶；参见下文），用于在活细胞线粒体中对超氧化物进行高选择性检测 ()。MitoSOX Red 指示剂的阳离子三苯基鏻取代基在主动呼吸的线粒体中负责电泳驱动型探针的摄取。经超氧化物氧化的 MitoSOX 红色指示剂（或二氢乙锭），导致 2 位羟基化（图 12.2.6）。2-羟基乙锭（和 MitoSOX 红色指示剂的相应衍生物）在 ~400 nm 处出现荧光激发峰， 而在由超氧化物以外的活性氧产生的乙锭氧化产物的激发光谱中则不存在该激发峰。因此，400nm 处的荧光激发和约 590nm 处的荧光检测是区分超氧化物和其他活性氧的最佳方法 （图 12.2.7）。

在表达半胱天冬酶切割的 tau 微管相关蛋白的小鼠皮层神经元中，使用 MitoSOX 红色指示剂生成线粒体超氧化物的测量与细胞溶质，线粒体钙和线粒体膜电位荧光指示剂的读数相关。 在小鼠大脑脑星形胶质细胞中，使用氨基苯乙烯基染料底物 4-Di-1-ASP 测定了线粒体超氧化物生成与多巴胺转运体活性的关系。 MitoSOX Red 指示剂已用于共聚焦显微镜分析反应氧化物 (ROS)，该氧化物由透膜猫心室肌细胞中的线粒体 NO 合酶 (mtNOS) 生成 ，以及与 Amplex Red 试剂结合使用，用于测量大鼠血管内皮细胞中的线粒体超氧化物和过氧化氢生成物。 除了成像和显微镜光度测定测量外，还报告了 MitoSOX Red 的多种流式细胞分析的应用。Mukhopadhyay 及其同事工布了通过流式细胞术同时测量人冠状动脉内皮细胞中线粒体超氧化物生成和细胞凋亡标志物 APC 膜联蛋白 V （A35110， 细胞凋亡检测—第 15.5 节） 和 SYTOX Green （S7020， 核酸染色剂—第 8.1 节）的详细方案。

RedoxSensor Red CC-1 染色剂（2,3,4,5,6-四氟甲基二氢罗丹明）被动进入活细胞，随后在细胞质中氧化为红色荧光产物（最大激发/发射波长约为 540/600 nm），然后在线粒体中蓄积。或者，将这种非荧光探针转运至溶酶体，然后进行氧化。线粒体和溶酶体间氧化产物的差异分布似乎取决于胞质的氧化还原电位。 在增殖细胞中，线粒体染色占主导地位；而在接触抑制的细胞中，溶酶体染色占主要地位 ()。

绿色荧光 JC-1 探针（5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑烯酰亚胺碘化物， T3168）以低浓度或低膜电位单体形式存在。然而，在较高 µm（水溶液超过 0.1 µM）或较高电位下，JC-1 形成红色荧光 "J- 聚集体"，其具有较宽的激发光谱，最大发射波长约为 590 nm (, , )。因此，这种花青染料的发射可作为线粒体膜电位的灵敏测量指标。通过结合来自绿色荧光 JC-1 单体（在水中的最大吸收/发射波长约为 514/529 nm）和 J-聚集体（可在 485nm 和 585nm 之间被激发，最大发射波长为 590 nm）的信号，进行各种类型的比率检测。红色与绿色 JC-1 荧光的比例仅取决于膜电位，而不取决于其他可能影响单组分荧光信号的因素，如线粒体大小，形状和密度。为荧光素和四甲基罗丹明设计的滤光片可分别可视化JC-1单体和J-聚集体。或者，可以使用标准荧光素长通滤光片组同时观察单体和 J-聚集体。Chen 及其同事使用 JC-1 通过比率技术研究活细胞中的线粒体电位 （图 12.2.8）。

JC-1 已与 Alexa Fluor 647 膜联蛋白 V （A23204， 细胞凋亡检测—第 15.5 节）结合使用，可通过流式细胞分析同时评估磷脂酰丝氨酸外化和线粒体功能。 我们还将 JC-1 作为 流式细胞分析 MitoProbe JC-1 检测试剂盒 （M34152， 慢响应探针—第 22.3 节）的一部分。我们发现了另一种线粒体标记物 JC-9 (3,3’-二甲基-β-萘酚唑啉鎓碘化物， D22421； ），其化学结构不同，但电位依赖性光谱特性相似。然而，JC-9 的绿色荧光基本不随膜电位的变化而发生变化，但红色荧光在超极化膜电位情况下会显著增加。

罗丹明 (Rhodamine) 123

罗丹明 123 (R302) 是一种可透过细胞的阳离子荧光染料，可被活性线粒体轻松吸收且无细胞毒性。 与 DASPMI (4-Di-1-ASP) 等染料相比，罗丹明 123 的摄取和平衡速度很快（几分钟），而 DASPMI 可能需要 30 分钟或更长时间。 通过荧光素长通光学滤光片观察，由罗丹明 123 染色的细胞线粒体的荧光为黄绿色。然而，通过四甲基罗丹明长通滤光片观察，这些相同的线粒体显示为红色。与亲脂性罗丹明和碳氰酸酯染料不同，罗丹明 123 明显不会对内质网进行染色。

罗丹明 123 已用于多种细胞类型，如星形胶质细胞、神经元、 活细菌、 植物 和人类精子。 研究人员使用流式细胞仪，将罗丹明 123 与 Hoechst 33342 （H1399， H3570， H21492； 细胞核探针—第 12.5 节）结合以表征造血干细胞。 罗丹明 123 广泛用作 ATP 结合盒 (ABC) 药物转运体（细胞粘附，趋化作用，多药耐药性和谷胱甘肽—第 15.6 节）功能测定的底物。

罗氏胺和其他罗丹明衍生物，包括 TMRM 和 TMRE

其他线粒体选择性染料包括四甲基罗丹明（其荧光与用于多色应用的荧光素形成良好对比）和罗丹明 6G （其最大吸收波长介于罗丹明 123 和四甲基罗丹明胺之间）。四甲基罗丹明和罗丹明 6G 均用于检查多药耐药细胞中 P-糖蛋白介导排阻的效率 （细胞粘附，趋化性，多药耐药性和谷胱甘肽的探针—第 15.6 节）。罗丹明 6G 已用于研究微血管缺血再灌注损伤 以及嗜热细菌 PS3 中的 F₁-ATP 酶的刺激和抑制作用。

在低浓度下，某些亲脂性罗丹明染料可选择性地对活细胞中的线粒体染色。 我们观察到，罗丹明 B 低浓度己酸酯选择性地蓄积在线粒体中 () ，似乎相对无毒。我们已将这种探针纳入 酵母线粒体染色采样器试剂盒中 （Y7530，参见下文的说明）。在较高浓度下，罗丹明 B 己基酯和罗丹明 6G 可对动物细胞的内质网进行染色 （内质网和高尔基体探针—第 12.4 节）。

研究证明，线粒体和内质网中四甲基罗丹明甲基和乙酯 (TMRM, T668; TMRE, T669) 的蓄积由其膜电位驱动 (慢响应探针—第 22.3 节)）。此外，由于其疏水特性降低，这些探针对细胞表现出电位非依赖性结合，比罗丹明 6G 检测到的细胞低 10 至 20 倍。 四甲基罗丹明乙酯是动态和 原位 定量测量的最佳荧光染料之一—优于罗丹明 123，因为其被活细胞快速、可逆地摄取。 TMRM 和 TMRE 已用于测量与细胞溶质 Ca²⁺ 瞬变相关的线粒体去极化 ，以及成像时间依赖性线粒体膜电位。 高通量检测采用 TMRE 和我们的低亲和力 Ca²⁺ 指示剂 fluo-5N AM （F14204， 可见光激发的荧光 Ca2+ 指示剂—第 19.3 节）来筛选线粒体转换孔开放的抑制剂。

还原型罗丹明和松红胺

在活细胞中，无色的二氢环胺和二氢四甲基罗丹明被氧化成对线粒体染色的荧光产物。 然而，氧化可能发生在线粒体以外的细胞器中。二氢罗丹明 123 (D632， D23806) 在存在过氧化物酶， 铁或细胞色素 c 的情况下与过氧化氢反应形成罗丹明 123。这种还原型罗丹明已用于监测大鼠肥大细胞中的活性氧中间体 以及测定内皮细胞中的过氧化氢。 还原型罗氏胺的氯甲基衍生物 (MitoTracker Orange CM-H₂TMRos， M7511； MitoTracker Red CM-H₂XRos， M7513)，可通过醛类固定剂固定在细胞中，上文已详述。

碳花青

大多数带有短 (C₁–C₆) 烷基链（慢响应探针—第 22.3 节）的碳花青染料在低浓度 (<100 nm) 下使用时，对活细胞的线粒体进行染色；当在较高浓度 (>1 µM) 下使用时，具有戊基或己基取代基的碳酰基也会对内质网进行染色。DiOC₆(3) (D273) 可对活酵母 细胞和其他真核细胞中的线粒 体，以及跳动的心脏细胞中的肌质网进行染色。 该产品还用于证明线粒体沿微管运动。 线粒体或内质网结合的 DiOC₆(3) 光解离可专门破坏细胞微管，而不影响肌动蛋白应激纤维，从而对细胞内细胞器运动产生高度局部抑制。 我们已在两种用于流式细胞分析的 MitoProbe 检测试剂盒（M34151， M34150； 慢响应探针—第 22.3 节）中纳入了 DiIC₁(5) 和 DiOC₂(3)。 慢速响应探针 - 第 22.3 节 中描述的几种其他电位敏感的碳花青探针还可对活细胞中的线粒体进行染色。 碳花青 DiOC₇(3) （其光谱与荧光素的光谱相似），是一种多功能染料，有报告称其是植物细胞中线粒体的灵敏探针。

苯乙烯基染料

苯乙烯基染料 DASPMI (4-Di-1-ASP) 和 DASPEI 可用于染色活细胞和组织中的线粒体。 这些染料的荧光斯托克斯频移大，且摄入速度（膜电位函数）相对较慢。采用高浓度跃迁法，研究了苯乙烯吡啶染料对线粒体染色的动力学。

壬基吖啶橙

壬基吖啶橙 (A1372) 可在活 HeLa 细胞线粒体中良好保留长达 10 天，使其成为一种有效探针，可在细胞分离期间及细胞融合后跟踪线粒体状态。 据报告，该异染性染料的线粒体摄取不依赖于膜电位。故无论其是否处于带电状态，在高浓度下均具有毒性， 且明显与所有线粒体中的心磷脂结合。 该衍生物已用于线粒体流式细胞分析， 多药物耐药性 (细胞粘附，趋化性，多药耐药性和谷胱甘肽—第 15.6 节) 表征，以及测量大鼠胸腺细胞凋亡期间线粒体质量的变化。

羧基 SNARF-1 pH 指示剂

通过一种特殊的细胞上样技术，我们可以使用 SNARF 染料，进行线粒体内 pH 值比率测量。细胞上样 10 µM 5-(和 6-) 羧基 SNARF-1、乙酰氧基甲基酯、乙酸酯 （C1272； 用于近中性 pH 值下的探针—第 20.2 节），然后在室温下孵育 4 小时，导致羧基 SNARF-1 染料高度选择性地定位在线粒体内()，并在线粒体内对线粒体 pH 值的变化做出反应。

光泽精

著名的化学发光探针光泽精会在肺泡巨噬细胞的线粒体中蓄积。 需要相对较高浓度的染料（约 100 µM）进行染色荧光；然而，据报告，低浓度染料对线粒体内受刺激生成的超氧化物产生化学发光反应。 分子探针葡萄糖地高辛（要了解更多信息，请联系 定制服务部）已高度纯化，以去除某些商业样品中存在的明亮蓝色荧光污染物。

用于荧光显微镜的 Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒

线粒体膜通透性转换孔，是位于线粒体内外膜的非特异性通道，似乎参与细胞凋亡和坏死性细胞死亡过程中线粒体成分的释放。在健康的细胞中，线粒体内膜负责维持呼吸和能源生产所必需的电化学梯度。随着线粒体对 Ca²⁺ 的摄入和释放，低电导通透性转换孔似乎在开放状态和封闭状态之间闪烁。 在细胞死亡过程中，线粒体膜通透性转换孔的打开显著改变了线粒体的渗透性。持续孔隙激活是由线粒体 Ca²⁺ 超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡条件引起的。 在持续孔激活后观察到，线粒体释放的细胞色素 c 和线粒体膜电位丧失。

基于已发表的线粒体转换孔开放实验， Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒 (I35103) 相对仅基于线粒体膜电位的检测来说，能更直接地检测线粒体转换孔的开放。本试剂盒采用钙黄绿素的乙酰氧甲基酯 (AM)（一种无色、无荧光的酯酶底物），以及钙黄绿素荧光淬灭剂 CoCl₂来选择性地标记线粒体。加至细胞后，钙黄绿素AM被动扩散进入细胞，并在细胞器包括线粒体内聚集。一旦进入细胞，钙黄绿素AM可被细胞内酯酶分解并释放出极性荧光染料钙黄绿素，这种荧光染料在短时间内不能大量透过线粒体膜或者细胞膜。当线粒体内钙黄绿素荧光保持稳定时，添加CoCl₂淬灭细胞质内的钙黄绿素荧光。作为对照，也可以用离子酶素等 Ca²⁺ 离子载体（I24222, 螯合剂, 校准缓冲液, 离子载体与细胞装载试剂—第 19.8节）处理已负载钙黄绿素 AM 和 CoCl₂ 的细胞，使过量的 Ca²⁺ 进入细胞，激活线粒体转换孔，继而淬灭线粒体钙黄绿素荧光。离子酶素的这一反应可被环孢素 A 所抑制，据报道环孢素 A 化合物通过结合亲环蛋白 D 阻止线粒体转换孔的形成。

已使用 HeLa 细胞和牛肺动脉内皮细胞 (BPAEC) 对 Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒进行验证。每个 Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒提供用于 100 次检测（基于 1 mL 标记量）的足够试剂，包括：

• Calcein AM
• MitoTracker Red CMXRos，一种红色荧光线粒体染色剂（最大激发/发射波长约 579/599 nm）
• Hoechst 33342，一种蓝色荧光细胞核染色剂（最大激发/发射波长约 350/461 nm）
• 离子酶素
• CoCl_2.
• 二甲基亚砜 (DMSO)
• 详细的实验方案（Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒）

用于流式细胞仪的 MitoProbe 转换孔检测试剂盒

基于已发表的线粒体转换孔开放实验， Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒 (M34153) 相对仅基于线粒体膜电位的检测来说，能更直接地检测线粒体转换孔的开放（图 112.2.9）。与上述 Image-iT LIVE 线粒体转换孔检测试剂盒一样，本检测试剂盒采用了钙黄绿素的乙酰氧基甲酯 (AM)（一种无色、无荧光的酯酶底物），以及钙黄绿素荧光淬灭剂 CoCl₂来选择性地标记线粒体。加至细胞后，钙黄绿素AM被动扩散进入细胞，并在细胞器包括线粒体内聚集。一旦进入细胞，钙黄绿素 AM 可被细胞内酯酶分解并释放出极性荧光染料钙黄绿素，这种荧光染料在短时间内不能大量透过线粒体膜或者细胞膜。当线粒体内钙黄绿素荧光保持稳定时，添加CoCl₂淬灭细胞质内的钙黄绿素荧光。作为对照，也可以用 Ca²⁺ 离子载体（如 离子霉素） （I24222, 螯合剂, 校准缓冲液, 离子载体与细胞装载试剂—第 19.8节）处理已负载钙黄绿素 AM 和 CoCl₂ 的细胞，使过量的 Ca²⁺ 进入细胞，激活线粒体转换孔，继而淬灭线粒体钙黄绿素荧光。离子酶素的这一反应可被环孢素 A 所抑制，据报道环孢素 A 化合物通过抑制亲环蛋白 D（cyclophilin D）阻止线粒体转换孔的形成。

已使用 Jurkat 细胞、MH1C1 细胞及牛肺动脉内皮细胞 (BPAEC) 对 MitoProbe 线粒体转换孔检测试剂盒进行验证。每个 MitoProbe 转换孔检测试剂盒提供用于 100 次检测（基于 1 mL 标记量）的足够试剂，包括：

• Calcein AM
• CoCl_2.
• 离子酶素
• 二甲基亚砜 (DMSO)
• 详细的实验方案（MitoProbe 转换孔检测试剂盒）

由于荧光显微镜已广泛用于研究酵母菌， 我们提供了一种 酵母线粒体染色采样试剂盒 (Y7530)。该试剂盒包含五种不同样品量的探针，研究发现这些探针可选择性标记酵母菌线粒体。提供的探针既表征明确的，又有专有的线粒体选择性：

• 罗丹明 123
• 罗丹明 B 己基酯 ()
• MitoTracker Green FM
• SYTO 18 酵母线粒体染色剂
• DiOC₆(3)

该试剂盒中包含的线粒体选择性核酸染料— SYTO 18 酵母线粒体染料在与核酸结合后，荧光明显增强，即使存在染料，也会产生非常弱的背景荧光。SYTO 18 是活酵母中的一种有效线粒体染色剂，但既不能穿透又不能染色高密度真核细胞的线粒体。

内源性生物素化蛋白存在于哺乳动物细胞，细菌，酵母菌和植物—生物素羧化酶—几乎仅存在于线粒体中，生物素合成发生；因此，线粒体可被几乎所有荧光基团或酶标记的亲和素或链霉亲和素衍生物 (亲和素，链霉亲和素， NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白和亲和基质—第 7.6 节；  分子探针亲和素、链霉亲和素、NeutrAvidin 和 CaptAvidin 偶合物—表 7.9； , ）选择性染色，而不使用任何生物素化配体。 这种染色会使亲和素 - 生物素技术在基于细胞的敏感检测中的应用复杂化，可利用我们的内源性生物素封闭试剂盒 (E21390， 亲和素，链霉亲和素， NeutrAvidin 和 CaptAvidin 生物素结合蛋白和亲和基质—第 7.6 节) 进行封闭。

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