细胞粘附、趋化性、多药耐药性和谷胱甘肽探针—第 15.6 节

目录

• 细胞粘附检测
• 趋化性检测
• 多药耐药性检测
• 谷胱甘肽测定
• 数据表
• 订购信息

细胞-细胞和细胞-基质粘附在生物、器官和组织形态和发育中的基础作用，使得细胞粘附分子介质的鉴定成为细胞生物学和免疫学的重要研究重点。 Löster 和 Hortstkorte 撰写的这篇实用评论描述了多种可以检测细胞粘附的不同检测方法。 在典型的荧光细胞粘附实验中，将多孔板中未标记的单层细胞与标记有荧光的细胞混合培养，然后洗涤以分离粘附和非粘附细胞。然后，只需将保留的荧光与细胞数量相关联，即可确定细胞粘附性。理想的荧光标记物应保持荧光与细胞数量之间的比例关系，并且对细胞粘附过程的影响最小。由于粘附是一种细胞表面现象，因此，与标记细胞表面分子的化合物相比，被动加载的细胞质标记物更可取，前提是它们在实验期间保留在细胞中，或者可以独立测量其泄漏率。荧光染料标记的细胞与诸如骨基质的粘附可通过荧光显微镜直接观察，使用细胞装载的渗透性活细胞示踪剂，如膜渗透性反应性示踪剂—第 14.2 节和细胞活力和细胞毒性测定试剂—第 15.2 节中描述的，或膜标记示踪剂—第 14.4 节中的亲脂性染料。或者，高分子量、细胞不可渗透的荧光葡聚糖（荧光和生物素化葡聚糖—第 14.5 节）已被用于定义粘附细胞外的区域，而粘附细胞本身保持未染色。 这种"负染"方法也可用于评估细胞扩散和融合进展。

使用酶底物的细胞粘附测定

基本上，所有在细胞活力研究中的酯酶底物—表 15.1中可用于监测细胞活力的酯酶底物，也可用于研究细胞粘附性。与细胞活力研究一样，钙黄绿素 AM（C1430、C3099、C3100MP）似乎最能满足细胞粘附性检测的标准，并且对细胞活力和其他细胞功能的影响最小。 使用钙黄绿素 AM 进行白细胞粘附试验的结果与使用 ⁵¹Cr 试验的结果非常吻合，但钙黄绿素 AM 方案所需时间更短，且避免了使用放射性物质时所需的特殊处理。钙黄绿素 AM 已被用于多种细胞粘附检测，包括用于测量以下指标的检测：

• 标记的 Jurkat 细胞与血管细胞粘附分子-1（VCAM1）在细胞膜制剂中的结合
• E-选择素结合肽和整合素对中性粒细胞粘附的影响
• 转染 K562 细胞和 BSC-1 细胞中整合素介导的细胞粘附
• 白细胞和中性粒细胞对内皮细胞的粘附
• HIV 感染细胞中的单核细胞粘附

其他用于评估细胞粘附的荧光酯酶底物包括 BCECF AM（B1150、B1170、B3051；BCECF）、羧基荧光素二乙酸酯（5(6)-CFDA、C195）、荧光素二乙酸酯（F1303）、 琥珀酰亚胺酯（5(6)-CFDA，SE；CFSE；C1157）和 CellTracker Green CMFDA（C2925，C7025），所有这些试剂都在细胞活力和细胞毒性检测试剂—第 15.2节中进行了讨论。由于钙黄绿素 AM 标记的细胞可能会缓慢渗出钙黄绿素，因此建议使用 CellTracker Green CMFDA 和 5(6)-CFDA SE 进行需要超过一小时孵育时间的定量粘附或聚集分析。 将绿色荧光染料（通常是钙黄绿素 AM、BCECF AM 或 CMFDA）与红色荧光染料（尤其是氯甲基 SNARF-1 乙酸盐（C6826）、SNARF-1 羧酸、乙酸盐、琥珀酰亚胺酯（S22801， 细胞计数、细胞增殖和细胞周期测定—第 15.4 节）或羧基萘黄素二乙酸酯（C13196，细胞存活和细胞毒性测定试剂—第 15.2 节）—可对混合细胞培养中的粘附或细胞聚集进行双色测量。 Calcein AM 还用于定量微孔板分析人工或生物表面粘附细胞的扩散。

在他们的评论中，Loster 和 Hortstkorte 描述了其他一些用于定量细胞粘附的荧光底物，其中包括荧光素二磷酸（F2999，检测磷酸盐和多磷酸盐代谢酶—第 10.3 节）和 ELF 97 磷酸盐（基于磷酸酶的信号放大技术—第 6.3 节），用于溶酶体和膜磷酸酶，以及糖苷酶（检测糖苷酶—第 10.2 节）和氧化酶（氧化酶底物，包括 Amplex Red 试剂盒—第 10.5 节）的各种底物。

Vybrant 细胞粘附检测试剂盒

Vybrant 细胞粘附检测试剂盒（V13181）利用钙黄绿素 AM 提供了一种快速、灵敏的细胞-细胞或细胞-基底粘附测量方法。 钙黄绿素 AM 是非荧光的，但一旦进入细胞，就会被内源性酯酶裂解，产生钙黄绿素，这是一种高荧光且保持良好的染料。钙黄绿素是一种明亮的绿色荧光、与pH值无关的细胞质细胞标记物，似乎不会影响细胞粘附过程。

为了进行这项实验，将钙黄绿素AM标记的细胞样本加入到微孔板中未标记的单层细胞中。在孵育一段时间后，标记的细胞会粘附到未标记的细胞上，然后清洗样本，去除未粘附的标记细胞（图 15.6.1）。然后，与未标记的对照样品相比，该样品中的钙黄绿素荧光可用于计算粘附细胞的数目。钙黄绿素的吸收/发射最大值（约 494/517 nm）非常适合由配备标准荧光素滤光片的荧光微孔板读数器进行检测。

除了钙黄绿素 AM，Vybrant 细胞粘附检测试剂盒还包括 SYTOX Green 核酸染色剂，这是一种易于使用的死细胞指示剂，用于在细胞粘附检测前评估细胞的总体健康状况。作为荧光染料，这种高亲和性核酸染料可以轻松穿透膜受损的细胞，但不会穿过活细胞的膜。与核酸结合后，SYTOX Green 染料会增强 >500 倍的荧光，并可通过标准荧光素滤光片（激发/发射约 504/523 nm）进行观察。

Vybrant细胞粘附检测试剂盒含有足够的试剂，使用荧光微孔板读数器可进行约 1000 次检测，包括：

• 钙黄绿素 AM
• SYTOX 绿色核酸染料，一种易于使用的绿色荧光指示剂，可在进行细胞粘附检测前用于检测细胞的整体健康状况
• 详细方案（Vybrant 细胞粘附检测试剂盒）
  

图 15.6.1 Vybrant 细胞粘附检测试剂盒（V13181）的原理。微孔板孔可不做处理，也可预先涂覆细胞外基质蛋白、抗体或其他试剂。

使用 CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒进行细胞粘附检测

我们的 CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒（C7026、C35006、C35007、C35011、C35012；细胞计数、细胞增殖和细胞周期检测试剂盒—第 15.4 节）也是定量细胞-细胞和细胞-表面粘附的重要工具。CyQUANT GR、CyQUANT NF 和 CyQUANT Direct 检测法可检测细胞中的总核酸，线性检测范围分别为每孔 50 至 50000 个细胞和每孔 100 至 20000 个细胞（图 15.6.2）。为了定量细胞表面粘附，只需让细胞粘附在表面上，轻轻清洗掉非粘附细胞，然后使用 CyQUANT 检测方法分析粘附细胞中的总核酸。作为对照，在清洗步骤之前，加入孔中的细胞总数可通过相同的检测方法确定，从而得出粘附细胞的百分比。通过定量分析最初贴壁的细胞数量和引入第二种细胞系并使其贴壁后的总细胞数量， CyQUANT 检测法也可以扩展到细胞-细胞粘附的研究中。已报道了基于 DAPI（D1306、D3571、D21490；核酸染色—第 8.1 节）的类似细胞粘附测定法。

图 15.6.2 使用 CyQUANT 细胞增殖测定试剂盒（C7026）对 NIH 3T3 成纤维细胞进行定量。使用微孔板读数器进行荧光测量，激发波长为 485 nm，发射波长为 530 nm。在此条件下，该检测方法的线性范围为每 200 µL 样品 50 至 50,000 个细胞。插图显示了在极低细胞数量下获得的线性关系。

微球粘附检测

在研究活体神经组织切片（包括海马切片）粘附性的新方法中，将荧光 4 µm 微球（F8858、F8859；微球—第 6.5 节）涂覆分离的活细胞膜。然后将包膜的微球接种到活组织切片上，经过短暂培养后，通过洗涤去除不粘附的微球（图 15.6.3）。然后，通过荧光显微镜观察粘附微球的组织标记模式。 基于流式细胞仪的微球粘附测定法也已开发出来，用于测定整合素特异性粘附，以及分析B系急性淋巴细胞白血病中整合素介导的粘附缺陷。 不同颜色（或大小或强度）的荧光微球（微球—第 6.5 节）可用于同时标记不同的粘附因子。

图 15.6.3 微球粘附检测的示意图。将膜包被微球在一滴培养基中加入到活组织切片中 (图 A)。微球分散在培养基中，最终覆盖组织切片（B 和 C）。培养后，通过大量清洗去除不粘附的微球，样品即可通过荧光显微镜进行分析（图 D）。

荧光纤维蛋白原

纤维蛋白原是血液凝固过程中的关键成分，通过与糖蛋白 IIb-IIIa（GPIIb-IIIa）受体（也称为整合素 α_IIbβ₃）结合，可支持血小板与血小板以及血小板与表面之间的相互作用。虽然其机制尚不明确，但纤维蛋白原结合需要激活 GPIIb-IIIa，从而引发血小板活化、粘附、扩散和人体内皮细胞的微丝重组。 可溶性纤维蛋白原与受体的结合依赖于Ca²⁺，其表观 K_d 为 0.18 µM。 这种结合显然是由三肽序列 Arg-Gly-Asp（RGD）介导的，该序列存在于纤维蛋白原和纤维粘连蛋白以及其他一些蛋白质中。

荧光标记的纤维蛋白原已被证明是研究血小板活化和随后纤维蛋白原结合的有价值的工具。荧光素纤维蛋白原已被用于通过流式细胞术鉴定活化的血小板。 荧光素纤维蛋白原与活化血小板结合已被证明是可饱和的，并且可被未衍生化的纤维蛋白原完全抑制。 荧光素纤维蛋白原在静脉血管内皮边缘的优先结合和积累已通过定量荧光显微镜进行了研究。 我们提供五种人纤维蛋白原荧光结合物，可用于研究血小板活化和随后的纤维蛋白原结合，使用荧光显微镜或流式细胞仪（图 15.6.4）：

• Alexa Fluor 488 人纤维蛋白原（F13191）
• Oregon Green 488 人纤维蛋白原（F7496）
• Alexa Fluor 546 人纤维蛋白原（F13192）
• Alexa Fluor 594 人纤维蛋白原结合物（F13193）
• Alexa Fluor 647 人纤维蛋白原结合物（F35200）

图 15.6.4 荧光标记的纤维蛋白原与活化血小板相互作用。首首先将全血与 R-藻红蛋白（R-PE）标记的抗 CD41 抗体孵育，以标记血小板。加入 20 µM的5'-二磷酸腺苷（ADP）以激活血小板，然后加入 2 µg/mL 的 Alexa Fluor 488 纤维蛋白原（F13191）并与样品孵育 5 分钟。使用 488 nm 的激发光，通过流式细胞术对细胞进行分析。无论是否激活，血小板均显示出抗CD41抗体的结合；然而，只有激活的血小板显示出与纤维蛋白原的强结合。每个实验中共显示 5000 个血小板。

荧光明胶和胶原蛋白

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，在脊椎动物中约占细胞总蛋白的 25%。这种重要的蛋白质不仅具有结构作用，而且对细胞粘附和迁移也很重要。已证实特定的胶原蛋白受体、纤维粘连蛋白和许多其他参与细胞-细胞和细胞-表面粘附的蛋白质能够结合胶原蛋白和明胶（变性胶原蛋白）。用于研究胶原蛋白结合蛋白和胶原蛋白代谢的明胶和胶原蛋白的荧光结合物，以及明胶酶和胶原酶（检测肽酶和蛋白酶—第 10.4 节），它们是消化明胶和胶原蛋白的金属蛋白。

我们提供两种绿色荧光明胶结合物—荧光素明胶（G13187）和俄勒冈绿 488 明胶（G13186）。与荧光素结合物相比，俄勒冈绿 488 结合物具有几乎相同的荧光光谱，但其荧光更稳定，对 pH 值的依赖性也更小。我们还提供胶原包被黄绿色荧光微球（F20892、F20893；用于追踪受体结合和吞噬作用的探针—第 16.1 节）。与这些蛋白质的荧光素结合物所获得的结果类似，这些高荧光明胶结合物和胶原包被微球可用于：

• 追踪整合素介导的吞噬作用
• 在培养细胞上定位表面纤维蛋白原
• 使用荧光偏振研究溶液中纤维蛋白原-明胶的相互作用
• 使用原位凝胶酶谱分析法可视化明胶酶活性

使用细胞计数直接检测趋化性

趋化性是指细胞定向运动到细胞外梯度，在受精、炎症、伤口愈合和造血过程中起着重要作用。 通常通过测定通过"特殊趋化室"迁移的存活细胞数量来检测趋化性。据报道，96 孔一次性趋化性试验室适用于荧光检测，比目视检测的迁移试验更快速、更省力、更灵敏。 用于追踪活细胞趋化作用的探针通常与检测细胞存活率和细胞粘附性的酯酶底物相同（用于细胞存活率研究的酯酶底物—表 15.1），包括钙黄绿素 AM（C1430、C3099、C3100MP）、BCECF AM（B1150、B1170、B3051）和 CellTracker Green CMFDA（C2925、C7025）。钙黄绿素 AM 不会干扰淋巴细胞增殖或粒细胞或中性粒细胞趋化或超氧化物产生，而且与 BCECF AM 不同，钙黄绿素 AM 不会影响白细胞的趋化。

由于趋化作用涉及整个细胞的转移，因此仅计算细胞数量的检测方法（例如我们的 CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒（C7026，细胞计数、细胞增殖和细胞周期检测试剂盒—第 15.4 节））对于追踪趋化作用也相当可靠。 此外，绿色荧光染料 SYTO 13（S7575，核酸染料—第 8.1 节）已被用于追踪分别染色的人群中性粒细胞的共同迁移，使用相反梯度的白三烯 B₄ 和白细胞介素 8 作为趋化剂。

趋化受体探针

我们制备了趋化性六肽N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys（F1314）的荧光素结合物，该结合物可与 fMLF 受体结合（用于追踪受体结合和吞噬作用的探针—第 16.1 节）。我们还提供荧光素标记的酪蛋白（C2990），它已被用于通过流式细胞术证明人类中性粒细胞和单核细胞中特异性酪蛋白趋化受体。 用醋酸酯化松香激活的中性粒细胞已被证明在荧光素标记的酪蛋白结合方面表现出剂量依赖性增加。

多药耐药性（MDR）是一种复杂生物过程的现象，在临床和实验肿瘤学中越来越受到关注。 多药耐药性表型的特征是肿瘤细胞对结构和功能不同的抗癌药物产生获得性耐药性。导致这种多药耐药性的机制包括以下几种：

• 药物代谢酶编码基因的扩增
• 谷胱甘肽和谷胱甘肽结合酶水平升高
• DNA 拓扑异构酶突变
• 血浆膜 ATP 依赖性药物外排泵的过度表达 

根据底物和抑制剂特征，至少已识别出四种不同的血浆膜 ATP 依赖性药物外排泵。 由 MDR1 基因编码的维拉帕米敏感的 P-糖蛋白（Pgp）能够排出蒽环类药物、表鬼臼毒素、长春花碱、海葵素和其他细胞抑制剂。 BODIPY FL 紫杉醇（P7500；微管蛋白和其他细胞骨架蛋白探针—第 11.2 节）是 Pgp 介导转运的底物，已被用作肿瘤球体的探针。

许多肿瘤细胞不表达 Pgp，但通过第二种能量依赖性药物输出机制输出柔红霉素。 第三种能量依赖性药物输出机制与 MDR 相关蛋白（MRP）有关，该蛋白对谷胱甘肽 S-结合物具有高度选择性，并且受长春花碱和丙磺舒抑制。 此外，还有报道称，小鼠和大鼠成纤维细胞中存在第四种对丙磺舒敏感、对钒酸盐和维拉帕米耐药的谷胱甘肽 S-结合物输出系统。 通常用于追踪谷胱甘肽加合物转运的探针与测量细胞内谷胱甘肽水平的探针相同（见下文）：单氯联苯（M1381MP）和 CellTracker Green CMFDA（C2925、C7025）。

显然，MDR 的机制非常复杂，在某些情况下，对底物的选择性会重叠。 我们提供 Vybrant 多重耐药性检测试剂盒，以及各种有用的荧光探针，用于监测 MDR 表型的各个方面。

使用乙酰氧甲基酯的多重耐药性检测

荧光钙指示剂（如 indo-1 AM和fluo-3 AM（I1203、F1241、F23915；可见光激发荧光钙指示剂—第 19.3 节））和 其他染料，如钙黄绿素 AM（C1430、C3099、C3100MP），可从表达 Pgp 的细胞中快速排出，为 MDR1 编码的 Pgp 的功能测定提供了新型高灵敏度探针。钙黄绿素 AM（而非钙黄绿素）是分离膜中 Pgp 的激活剂，其 K_d≤1 µM。 表达 MDR1 编码 Pgp 的细胞会迅速清除非荧光探针钙黄绿素 AM，导致细胞质中高荧光钙黄绿素的积累减少。 钙黄绿素 AM 也是 MDR 相关蛋白（MRP）的底物，尽管在这种情况下，亲水的游离钙黄绿素阴离子也会被排出。 由于钙黄绿素本身不是 MDR1 编码的Pgp的底物，因此可以通过测量细胞内荧光净积累来定量评估 MDR。 细胞内谷胱甘肽的耗竭不会影响 MDR1 编码的 Pgp 对钙黄绿素 AM 的排出。 通过添加 Co²⁺ 完全淬灭细胞外染料的荧光，可以区分细胞内钙黄绿素的荧光和渗漏到培养基中的钙黄绿素的荧光。 针对 Pgp 相关 MDR 的专利钙黄绿素 AM 检测法适用于流式细胞术或荧光测定法，比基于阿霉素累积的传统检测法更快速、更灵敏。 通过荧光显微镜也可以观察到MDR细胞中钙黄绿素的积累减少。

Vybrant 多药耐药性检测试剂盒

Vybrant 多药耐药性检测试剂盒（V13180）基于 Tiberghien 和 Loor 开发的基于荧光微孔板的方法，为大规模筛选MDR抑制剂提供了一种快速简便的方法。该检测法利用荧光染料钙黄绿素AM作为 Pgp 外排活性的底物。钙黄绿素在细胞内酯酶的作用下水解后，会很好地保留在细胞质中，而且与 BCECF AM 或 fura-2 AM 等其他荧光Pgp底物的水解产物不同，其荧光既不依赖于 pH 也不依赖于钙离子。表达高浓度 Pgp 的多药耐药细胞会迅速将无荧光的钙黄绿素 AM 从细胞膜中排出，从而减少细胞质中荧光钙黄绿素的积累（图 15.6.5）。Pgp 活性的多少与细胞内钙黄绿素荧光积累成反比。该检测方法设计用于荧光微孔板读数器，尤其适用于快速、灵敏地筛选多药耐药细胞系中的候选 Pgp 抑制剂。钙黄绿素的吸收/发射最大值（494/517 nm）非常适合配备标准荧光素滤光片的仪器检测。Vybrant 多药耐药性检测试剂盒（V13180）含有足够的试剂，使用荧光微孔板读取器可进行约 10,000 次检测，包括：

• 钙黄绿素 AM
• 环孢菌素 A，一种与 Pgp 结合的药物竞争性抑制剂
• 维拉帕米，一种非竞争性抑制Pgp活性的钙通道阻滞剂
• 详细方案（Vybrant 多药耐药性检测试剂盒）

图 15.6.5Vybrant 多药耐药性检测试剂盒（V13180）原理。在正常细胞中，非荧光钙黄绿素 AM 很容易扩散穿过细胞膜。在钙黄绿素 AM 被内源性酯酶裂解后，荧光钙黄绿素会积聚在细胞质中。在 MDR 细胞中，MDR 转运蛋白的过度表达增加了钙黄绿素 AM 在酶水解其 AM 酯之前从细胞膜排出，从而减少了细胞内钙黄绿素的积累。

使用线粒体探针的 MDR 检测

在经典的 MDR 功能检测中，测量多柔比星外排。 这种检测的主要缺点是灵敏度低，这促使人们寻找其他荧光染料来监测药物外排。使用各种线粒体探针（线粒体探针—第 12.2 节）鉴定了过表达 Pgp 的多药耐药细胞，包括罗丹明 123（R302、R22420）、吖啶橙 10-壬基溴化物（壬基吖啶橙，A1372）和罗丹明 6G（R634）。此外，有报道称罗丹明 123 的荧光激发光谱在耐药细胞和敏感细胞中有所不同。

电位敏感的炭青素染料，包括二戊基、二己基和二庚基氧杂炭青素（D272、D273、D378；慢反应探针—第 22.3 节），在耐多药性检测中也有优于常用的阿霉素检测的优势。 这些炭青素染料不仅荧光更强，允许使用更低的染料浓度，而且它们与细胞膜结合后荧光增强，这与阿霉素的荧光不同，后者在细胞内基本被淬灭。 比率型电位敏感双 4-ANEPPS 探针（D1199，快速反应探针—第 22.2 节）已被用于证明MDR细胞的电位降低。

核使用核酸染料的 MDR 检测

MDR 细胞还通过减少核酸结合染料（如 Hoechst 33258（H1398、H3569、H21491；核酸染色剂—第 8.1 节）、Hoechst 33 342（H1399、H3570、H21492；核酸染色—第 8.1 节）和溴化乙锭（E1305、E3565；核酸染色—第 8.1 节）。SYTO 16 绿色荧光核酸染色剂（S7578，核酸染色剂—第 8.1 节）被证明是一种有效的底物，可用于通过流式细胞术检测 Pgp 介导的耐药性，以及通过共聚焦激光扫描显微镜检测单细胞。 我们的四款 SYTO 荧光核酸染色取样试剂盒（S7572、S11340、S11350、S11360；核酸染色—第 8.1 节）可提供荧光覆盖整个可见光谱的 SYTO 染料样品；这些染料可用于检测 MDR 细胞。

BODIPY FL 维拉帕米和二氢吡啶

Ca²⁺ 通道阻滞剂维拉帕米是已知几种抑制 Pgp 介导的药物外排的分子之一。 我们提供绿色荧光 BODIPY FL 维拉帕米探针（B7431），用于研究 Pgp 的功能和定位。维拉帕米似乎通过充当 Pgp 的底物来抑制药物外排，从而抑制转运蛋白排出其他药物的能力。我们的维拉帕米 BODIPY FL 结合物具有与荧光素相似的光谱特性，也可作为 Pgp 的底物。这种荧光维拉帕米衍生物优先积聚在正常、对药物敏感的 NIH 3T3 细胞的溶酶体中，但通过荧光显微镜观察发现，它会迅速从 MDR 细胞中排出。 未衍生化的维拉帕米以及过量的长春碱会抑制 BODIPY FL 维拉帕米从 MDR 细胞中的外排。

与维拉帕米一样，二氢吡啶类药物也会抑制药物外排。因此，我们用绿色荧光 DM-BODIPY（D7443，离子通道和载体探针—第 16.3 节）或橙色荧光 ST-BODIPY（S7445，离子通道和载体探针—第 16.3 节）标记的荧光二氢吡啶可能是有效的 MDR 探针。

BODIPY FL 长春碱

抗肿瘤药物长春碱可抑制 Pgp 介导的多药耐药细胞对多种药物和其他探针的排出。我们的 BODIPY FL 长春碱结合物（V12390）可用作高荧光长春碱类似物。 之前已报道过一种生物活性香豆素染料标记的长春碱。

BODIPY FL 哌唑嗪和 BODIPY FL 福斯可林

α₁-肾上腺素能受体拮抗剂哌唑嗪和腺苷酸环化酶激活剂佛司可林的光亲和类似物已被证明能够选择性地对分离的 Pgp 进行光标记。 我们的绿色荧光 BODIPY FL 哌唑嗪（B7433）和 BODIPY FL 佛司可林（B7469）是研究 MDR 机制的有用工具。

甲氨蝶呤耐药性与基因扩增

肿瘤细胞通常会发生基因扩增，导致二氢叶酸还原酶（DHFR）的过度表达。DHFR 表达的增加（图 15.6.6）使细胞对甲氨蝶呤的细胞毒性作用具有更强的耐受性。 为了研究抗代谢物耐药性和自发基因扩增，我们提供了荧光甲氨蝶呤结合物。除了用于观察活细胞中生化网络的绿色荧光甲氨蝶呤（M1198MP）外，我们还提供了 Alexa Fluor 488 甲氨蝶呤（M23271），它具有与荧光素类似的光谱特性。荧光素甲氨蝶呤（M1198MP）与二氢叶酸还原酶（DHFR）的定量结合使研究人员能够根据 DHFR 的表达来分离细胞。 最初由 Gapski 及其同事描述的荧光素-1-羟基戊二胺加合物似乎在应用上与荧光素-1-赖氨酸-1-甲氨蝶呤相当。

图 15.6.6 分析 CHO 细胞中二氢叶酸还原酶（DHFR）的含量。将 DHFR+ 和 DHFR- 细胞混合，用 1 µM 荧光素甲氨蝶呤（M1198MP）在 37°C 下染色 2 小时。用荧光素甲氨蝶呤孵育后，用胰蛋白酶消化细胞，用磷酸盐缓冲液清洗，用 488 nm 激发光流式细胞仪进行分析。发射光在 525 nm 处收集。

三肽谷胱甘肽（γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸）是哺乳动物细胞中含量最高（细胞质中可达 10mM，血液中约为 1mM）且重要的非蛋白硫醇。谷胱甘肽在保护包括大脑在内的所有器官细胞免受自由基、氧化剂和亲电体的损害方面发挥着核心作用。多药耐药性（MDR）的显著机制包括：一种与多药耐药性相关的蛋白（MRP）通过能量依赖性膜泵从细胞质中清除谷胱甘肽 S-结合物的过量表达。有报道称，在抗 FAS/APO-1 抗体诱导的细胞凋亡过程中，谷胱甘肽从 Jurkat T 淋巴细胞中的排出率增加。

已有多种荧光试剂被用于测定细胞内谷胱甘肽和谷胱甘肽 S-转移酶（GST）的水平，后者催化谷胱甘肽 S-结合物的形成，但在活细胞定量研究中，没有一种探针是毫无缺陷的。细胞内谷胱甘肽水平较高且变化较大，且 GST 同工酶种类繁多，这使得在饱和底物条件下进行动力学测量变得困难甚至不可能。 GST 同工酶的丰度和活性均有所不同，这使分析更加复杂。 此外，用于测量谷胱甘肽的荧光试剂可能会与谷胱甘肽以外的细胞内硫醇发生反应，包括谷胱甘肽耗竭细胞中的蛋白质。 因此，在应用此处提到的试剂定量细胞中的谷胱甘肽或 GST 时必须采取预防措施。一种有用的策略是在谷胱甘肽耗尽的受控实验条件下测试多种谷胱甘肽敏感染料（需要谷胱甘肽 S-转移酶活性的染料，以及不依赖 GST 的荧光团）。

ThiolTracker Violet 谷胱甘肽检测试剂

ThiolTracker Violet 试剂（T10095、T10096）可与完整细胞中的还原型硫醇发生反应，其亮度是传统谷胱甘肽（GSH）检测试剂双马来酰亚胺的 10 倍。染色是通过将 ThiolTracker Violet 染料应用于无硫醇缓冲液中的活细胞，然后使用 405 nm 的紫色二极管激光或传统的氙弧灯或汞弧灯（激发/发射最大值约为 404/526 nm）直接成像标记的细胞来实现的。或者，由于这种细胞渗透性染料可以耐受甲醛固定和洗涤剂提取，因此可以在成像前对标记细胞进行免疫化学分析。

用单氯联苯胺测定谷胱甘肽

细胞渗透性单氯联苯（mBCl，M1381MP）在结合硫醇前基本上不发光，长期以来一直是定量细胞中谷胱甘肽水平和测量 GST 活性的首选硫醇反应探针。 由于单氯联苯胺的蓝色荧光谷胱甘肽加合物最终会积聚在细胞核中，因此它不能可靠地指示细胞核和细胞质中谷胱甘肽的分布。 也可以通过向组织匀浆中同时添加单氯联苯胺和谷胱甘肽 S-转移酶，用荧光法测量组织中的谷胱甘肽水平。

据报告，单氯比马啶与全细胞中的谷胱甘肽发生反应的选择性比单溴比马啶更高（M1378、M20381；紫外光激发硫醇反应探针—第 2.3 节），并且已被证明可用于通过流式细胞术和荧光显微镜检测耐药性。 此外，HPLC 分析表明，谷胱甘肽是肝细胞中唯一能与单氯联苯反应的低分子量硫醇。 用单氯联苯测定谷胱甘肽的结果与使用谷胱甘肽还原酶进行的独立谷胱甘肽特异性测定结果一致。 然而，虽然单氯联苯胺对啮齿动物细胞中的谷胱甘肽具有高度选择性，但据报道，由于其对人类谷胱甘肽 S-转移酶的亲和力较低，因此不能充分标记人类细胞中的谷胱甘肽。 还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP，T2556；硫醇修饰与检测简介—第 2.1 节）已被用于替代二硫苏糖醇（DTT ，D1532；硫醇修饰和检测简介—第 2.1 节）用于简化谷胱甘肽的单溴联苯胺检测，因此可能对单氯联苯胺检测也很有用。在单溴联苯醚基谷胱甘肽检测中，据报道需要提取步骤来去除 TCEP 和单溴联苯醚的荧光、还原脱卤副产物。 丙磺舒（P36400，螯合剂、校准缓冲液、离子载体和细胞装载试剂—第 19.8 节）可抑制ATP依赖性有机阴离子泵，并阻止荧光双烷-谷胱甘肽加合物从大鼠成纤维细胞中流失。 单氯双烷还被用于根据重组谷胱甘肽转移酶（GST）的表达对细胞进行分类。

用可见光激发硫醇反应探针测定谷胱甘肽

CellTracker Green CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯，C2925，C7025）是测定细胞内谷胱甘肽水平时，可替代紫外线激发单氯联苯胺的有用试剂。 CellTracker Green CMFDA 可被氩离子激光激发，与流式细胞仪和共聚焦激光扫描显微镜应用兼容。CellTracker Green CMFDA的酶促产物比单氯联苯胺具有更高的吸收率和荧光量子产率。与 Hoechst 33342（H1399、H3570、H21492；核酸染色剂—第 8.1 节）结合使用时，CellTracker Green CMFDA 还被证明使用流式细胞仪分析细胞周期时，可有效分析细胞内硫醇水平，跟踪多药耐药细胞中谷胱甘肽加合物向分泌囊泡的转运，并检测细胞凋亡，即细胞内还原型谷胱甘肽水平降低。 通过分离 >95% 的细胞内荧光产物（即谷胱甘肽加合物和未结合的水解产物氯甲基荧光素的混合物），证明 了CellTracker Green CMFDA 对谷胱甘肽（相对于硫醇化蛋白）的选择性。 然而，在这些实验中，未结合的氯甲基荧光素的高荧光度导致背景水平显著增加。由于谷胱甘肽消耗性化学物质也可能导致细胞死亡，因此建议在使用 CellTracker Green CMFDA 测量细胞内谷胱甘肽水平变化时，使用钙黄绿素AM来独立评估细胞活力。

与 CMFDA 一样，氯甲基 SNARF-1 乙酸盐（C6826）与细胞内硫醇形成加合物，而活细胞能够很好地保留这些加合物。氯甲基 SNARF-1 的谷胱甘肽加合物可通过氩离子激光的 488 nm 光谱线激发，但发射波长超过 630 nm，这可能在多色应用或检测自发荧光样品时具有优势。我们的一些其他细胞追踪剂（膜渗透反应示踪剂—第 14.2 节）和线粒体追踪剂（线粒体探针—第 12.2 节）具有硫醇反应性氯甲基部分，可能同样适用于谷胱甘肽测定。所有这些探针都能形成谷胱甘肽 S-结合物，后者可能由MDR相关蛋白（MRP）从细胞质中转运。

使用 BioGEE 检测谷胱甘肽化

生物素化谷胱甘肽乙酯（BioGEE，G36000）是一种细胞渗透性生物素化谷胱甘肽类似物，用于检测谷胱甘肽化。在氧化应激条件下，细胞可能会暂时将谷胱甘肽整合到蛋白质中。用 BioGEE 孵育的应激细胞也会将这种生物素化的谷胱甘肽衍生物整合到蛋白质中，从而有助于识别氧化敏感蛋白。 一旦这些细胞被固定并渗透，就可以使用流式细胞仪或荧光显微镜，通过荧光链霉亲和素结合物（亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素生物素结合蛋白和亲和基质—第 7.6 节，分子探针亲和素、链霉亲和素、中性亲和素和捕获亲和素结合物—表 7.9）检测谷胱甘肽化水平。用 BioGEE 进行谷胱甘肽化的蛋白质也可以通过质谱法或与荧光标记或酶标记的链霉亲和素结合物结合的蛋白印迹法进行提取和分析。

用邻苯二甲醛和萘-2,3-二甲醛测定谷胱甘肽

试剂邻苯二醛（OPA，P2331MP）可与谷胱甘肽的硫醇和胺功能发生反应，生成具有荧光的环状衍生物。OPA 与谷胱甘肽结合后的光谱（激发/发射最大值分别为350/420纳米）与蛋白质结合后的光谱有所不同。 这种效应有时被用于评估细胞中的谷胱甘肽水平。 OPA 还被用作细胞，血液和组织中谷胱甘肽色谱分析测定的衍生化试剂。

膜可透过性萘 -2 ， 3- 二甲醛 (NDA ， N1138) 已用于测定单细胞中的谷胱甘肽水平。用 NDA 试剂处理细胞，然后通过毛细管电泳进行分析； 报告谷胱甘肽标记在两分钟内完成。NDA 的谷胱甘肽加合物可被氩离子激光的 458 nm 光谱线激发。