磷酸化

虽然磷酸化是普遍的翻译后修饰 (PTM)，可用于调节蛋白功能，但其发生在真核细胞中的三个氨基酸（丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）的侧链中。此类氨基酸具有一个亲核 (–OH) 基团，可在通用磷酰基供体腺苷三磷酸三磷酸盐 (ATP) 上攻击末端磷酸基团 (γ-PO₃^2-)，从而将磷酸基转移到氨基酸侧链上。镁 (Mg²⁺) 可通过螯合 γ 和 β 磷酸基团以降低磷酰基转移至亲核 (–OH) 基团的阈值，从而促进这种转移。由于当 ATP 的磷酸盐键断裂形成腺苷二磷酸盐 (ADP) 时，会释放出的大量游离能量，因此该反应为单向反应。

丝氨酸磷酸化图。丝氨酸 (–OH) 基团中经酶催化的质子转移会刺激 ATP 上 γ 磷酸基发生亲核攻击，最终将磷酸基转移到丝氨酸以形成磷酸丝氨酸和 ADP。(— B：) 代表启动质子转移的酶基础。

对于大量蛋白亚群，磷酸化与蛋白活性紧密相关，并且是蛋白功能调节的关键点。磷酸化可通过引起磷酸化蛋白的构象改变，来调节蛋白功能和细胞信号转导。此类改变可能会以两种方式影响蛋白。首先，构象改变会调节蛋白质的催化活性。因此，蛋白可以通过磷酸化活化或失活。其次，磷酸化蛋白募集在结构上具有保守结构域的邻近蛋白，这些结构域可识别并与磷脂酰丝氨酸结合。这些结构域对不同氨基酸表现出特异性。例如，Src 同源 2 (SH2) 和磷酸化酪氨酸结合 (PTB) 结构域对磷酸化酪氨酸 (pY) 表现出特异性，但这两种结构中的差异为不同的磷酸化酪氨酸基序提供了每个结构域的特异性。磷酸丝氨酸 (pS) 识别结构域包括 MH2 和 WW 结构域，而磷酸苏氨酸 (pT) 则由叉头相关 (FHA) 结构域识别。磷蛋白募集其他蛋白的能力对于信号转导至关重要，其中下游效应蛋白被募集到磷酸化信号转导蛋白中。

蛋白磷酸化是由激酶和磷酸酶介导的可逆 PTM，其分别为磷酸化和去磷酸化底物。这两个酶家族促进细胞中磷酸化蛋白的动态性质。实际上，给定细胞中的磷酸化蛋白组大小取决于细胞中激酶和磷酸酶浓度的时间和空间平衡以及特定磷酸化位点的催化效率。

磷酸化是可调节蛋白功能的可逆 PTM。左图：蛋白激酶通过水解磷酸基团介导丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链磷酸化以及磷酸酶逆转蛋白磷酸化。右图：磷酸化会导致蛋白质的构象改变，从而让蛋白质功能活化（顶部）或失活（底部）。

激酶指有助于磷酸基团转移至底物的酶。在人蛋白组中对 500 多种激酶进行预测；该蛋白亚群包括人激酶组。激酶活性的底物多种多样，包括脂质、碳水化合物、核苷酸和蛋白质。

尽管只有少量激酶使用鸟苷三磷酸盐，但 ATP 几乎是所有蛋白激酶的共底物。ATP 是转移 α、β 或 γ 磷酸基团的理想结构，分别用于核苷酰基转移、焦磷酸基转移或磷酰基转移。虽然激酶的底物特异性有所不同，但 ATP 结合位点通常较为保守。

蛋白激酶分为亚家族，其对不同催化结构域具有特异性，包括酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸激酶。约 80% 的哺乳动物激酶组包括丝氨酸/苏氨酸激酶，并且 >90% 的磷酸化蛋白组由 pS 和 pT 组成。实际上，研究表明，细胞中 pS:pT:pY 的相对丰度比为 1800:200:1。尽管 pY 不像 pS 和 pT 一样普遍，但酪氨酸磷酸化通过受体酪氨酸激酶 (RTK) 的失调与人类疾病的关系，在全球处于生物医学研究的前沿。

蛋白激酶底物不仅对靶氨基酸具有特异性，还对其侧翼的共有序列具有特异性。通过这些共有序列，某些激酶将单蛋白和其他蛋白进行磷酸化，从而实现对多种底物 (>300) 的磷酸化。此外，如果激酶特异性共有序列可用，激酶可将单个蛋白上的单个或多个氨基酸磷酸化。

激酶具有可作为激活或自身抑制结构域的调节亚基，并具有多种调节底物。对这些亚基进行磷酸化是调节激酶活性的常用方法。大多数蛋白激酶在基础状态下可去磷酸化和失活，并通过磷酸化激活。少量激酶具有组成活性，在磷酸化时，本质上并未出现效率低下或无活性的情况。Src 等部分激酶需要磷酸化和去磷酸化组合变为活性，这表明该原癌基因具有高度调节性。支架和衔接蛋白还可以通过调节激酶与上游调节子和下游底物之间的空间关系来影响激酶活性。

通过用针对特异性激酶和 ATP 的底物孵育免疫沉淀物，可测定特异性激酶的活性。商用试剂盒适用于此类测定，旨在进行比色、辐射测量或荧光检测。虽然这种类型的测定可以显示特异性激酶的活性，但它与激酶富集一样，无法提供激酶修饰的蛋白或内源性磷酸酶活性的作用的信息。

由于蛋白磷酸化具有可逆性，因此这类 PTM 成为信号转导的理想选择，让细胞能够快速响应细胞内或细胞外刺激。信号转导级联由一个或多个蛋白物理感应提示，可通过配体结合、切割或某些其他应答进行表征，然后将信号转导转发至第二信使和信号转导酶。在磷酸化情况下，这些受体将激活下游激酶，然后进行磷酸化并激活其他激酶等其同源下游底物，直至发生特异性反应。信号转导级联可以为线性状态，其中激酶 A 激活激酶 B，从而激活激酶 C 等。已发现信号通路可扩增初始信号；激酶 A 激活多种激酶，后者继而激活其他激酶。通过这种类型的信号转导，生长因子等单分子就可以激活细胞增殖等整体细胞程序。

信号转导级联会放大信号输出。外部和内部刺激物可通过一系列第二信使和酶诱导多种细胞反应。线性信号转导通路产生离散数量的下游效应物的顺序活化，而其他刺激物会引发信号级联，从而扩增大规模或整体细胞反应的初始刺激。

磷酸化依赖性信号转导的强度和持续时间由以下三个机制调节：

• 去除活化配体
• 激酶或底物蛋白水解
• 基于磷酸酶的去磷酸化

人蛋白组估计包含约 150 种蛋白磷酸酶，该蛋白磷酸酶对 pS/pT 和 pY 残基具有特异性。虽然去磷酸化是这两组磷酸酶的最终目标，但二者均通过独立机制来实现。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶介导使用双金属（铁/锌）中心的磷酸基磷酸原子直接水解，而酪氨酸磷酸酶形成共价三氯硫磷中间体，有助于去除酪氨酸残基。

由于磷酸化对一般生物过程具有影响，人们高度重视对蛋白质磷酸化在人类疾病背景下的生物学作用的理解。通常使用小规模样本的蛋白磷酸化研究少量蛋白的活性，而越来越多使用磷酸化蛋白组学分析来了解整个蛋白家族磷酸化的全球动力学。目前研究蛋白磷酸化的方法包括免疫检测、磷蛋白或磷酸肽富集、激酶活性检测和质谱分析。由于磷酸酶对磷酸化蛋白检测存在不利影响，通常在许多磷酸化检测策略中将广谱磷酸酶抑制剂添加到细胞裂解物中。

免疫检测

针对靶蛋白上特异性磷酸化抗原决定簇孵育的磷酸化特异性抗体是研究位点特异性蛋白磷酸化的核心工具。在更为综合的范围内，研发了针对特定氨基酸（pS、pT 和 pY）磷酸化检测的抗体。磷酸化特异性抗体可用于传统的蛋白免疫印迹、免疫沉淀 (IP)、免疫组织化学 (IHC)、ELISA 和流式细胞分析，最近还应用于在固体支持物阵列上进行固定。尽管磷酸化特异性抗体在研究界得到了广泛使用，但它们中只有一小部分对其靶标具有高度特异性，许多抗体的灵敏度较低。

磷酸化特异性 ELISA 试剂盒。磷酸化特异性 Invitrogen ELISA 试剂盒为高品质 ELISA 试剂盒，专为研究信号通路中涉及的细胞内蛋白的研究人员而设计。这些检测试剂盒旨在为大量样本类型中的总特异性磷酸化修饰或切割位点蛋白质提供准确、灵敏和快速蛋白质定量。

在以下示例中，使用蛋白免疫印迹分析检测蛋白 p38 MAPK，该蛋白是在信号转导中起重要作用的丝氨酸/苏氨酸激酶，有助于调节细胞分化和炎症等许多细胞加工。

检测 p38 MAP 蛋白。通过分别上样 20 µg HeLa（泳道 1）、经 UV 照射 40 分钟的 HeLa（泳道 2）、A431（泳道 3）、经 UV 照射 40 分钟的 A431（泳道 4）、COLO 205（泳道 5）、经 UV 照射 40 分钟的 COLO 205（泳道 6）、A549（泳道 7）以及经 UV 照射 40 分钟的 A549（泳道 8），借助蛋白免疫印迹对 p38 [pT180]/[pY182] 进行分析。实验使用了 Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris 预制胶（货号：NP0322BOX）、XCell SureLock 电泳系统 (EI0002)、Novex Sharp 预染蛋白标准品 (LC5800) 和 iBlot 干式转印系统 (IB21001)。将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，在室温下用 5% 脱脂牛奶封闭 1 小时。使用 Invitrogen p38 [pT180]/[pY182] 家兔多克隆抗体 (44684G) 按 1:1000 的比例溶于 5 % 脱脂牛奶中，在 4°C 下在摇摆平台上过夜，可在 ~38 kDa 处检测到 p38 [pT180]/[pY182]。使用 Invitrogen 山羊抗兔 IgG–HRP 二抗 (G21234) 按 1:5000 稀释度进行，并使用 Invitrogen Novex ECL 化学发光底物试剂盒 (WP20005) 进行化学发光检测。

富集

在进行蛋白质组学分析前，需要富集的低丰度蛋白磷酸化发生关键动态变化。这些策略包括金属氧化亲和色谱法 (MOAC) 和固定化金属离子亲和色谱法 (IMAC)，二者使用金属配体复合物捕获 pS、pT 和 pY 上的磷酸基。MOAC 最常与 TiO2 螯合树脂一起使用磷酸盐形成双齿配复合物，而 IMAC 则采用铁螯合支持物形成三齿或四齿复合物。也可使用商用试剂盒（具有专用磷酸盐结合分子），用于磷蛋白富集。

另一种富集策略是在强碱条件下消除不稳定的磷酸基（β 消除）。磷酸基团由生物素部分取代，然后蛋白/多肽富集到亲和素支持物上。该方法的主要缺点在于无法通过 β 消除方式消除酪氨酸残基的磷酸基。

尽管该方法不提供此类酶所修饰的蛋白信息，但激酶 (ATPase) 和 GTP 酶也可富集。这些富集策略使用核苷酸衍生物，后者与激酶或 GTP 酶的活性位点（取决于所用衍生物）结合并介导修饰生物素（脱硫生物素）的共价结合。由于脱硫生物素表现出与链霉素亲和素的可逆结合，因此标记的激酶或 GTP 酶可以从样品中富集。

可使用下游蛋白的共有序列作为探针富集特异性酶。这种方法常与富集 GTP 酶配合使用，其中特异性 GTP 酶的下游效应物的蛋白结合结构域与 GST 融合，以选择性富集不同 GTP 酶。

下表提供了有关 Thermo Scientific Pierce 磷蛋白富集试剂盒的性能信息，该试剂盒旨在高效富集哺乳动物细胞和组织中的磷酸化蛋白。

定量串联质谱

近期采用细胞孵育氨基酸稳定同位素标记 (SILAC) 或在体外用串联质量标记肽标记的质谱策略，为相对测定磷酸化变化铺平了道路。

也可提供使用同位素"重"肽标准品的绝对定量策略。借助这些方法，研究人员能够针对不同刺激或疾病状态，理解全球磷酸化蛋白组学变化。下图显示了与 MS 蛋白样品制备相关的复杂性性质。磷酸肽富集降低了样品的复杂性，并且由于磷酸肽的化学计量低和电离度较差，因此需要在质谱分析之前进行。使用市售辅助试剂盒增强磷蛋白富集。

定量蛋白质组学分析的蛋白质可用性有限。蛋白质丰度和样品复杂性是影响蛋白用于质谱定量的可用性的重要因素。

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